[發明專利]魚類白細胞分離方法

有效

• 申請號: 201310197729.8
• 申請日: 2013-05-24
• 公開（公告）號: CN103289953A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 唐琳;曾伯平;王文彬;羅玉雙;李榮
• 申請（專利權）人: 湖南文理學院
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 常德市源友專利代理事務所 43208
• 代理人: 章祖斌

技術領域

本發明涉及一種動物白細胞的分離方法，特別涉及一種適用于體外培養的魚類白細胞分離方法。

背景技術

白細胞具有防御和免疫功能，在機體損傷治愈、抗御病原的入侵和對疾病的免疫方面起著重要的作用。要研究機體的免疫機制，獲得足夠數量、純度高和活性強的白細胞是基本條件，而白細胞的體外培養和刺激模式的建立是必要條件。現有的白細胞分離方法主要有兩種：一種是采用紅細胞裂解液直接裂解紅細胞而分離白細胞，另一種是采用淋巴分離液進行梯度離心而分離各血細胞組分。用第一種方法分離出來的白細胞純度高，但活性差，不適合進一步進行體外培養，因此用該方法分離的白細胞主要用于白細胞的臨時檢測；用第二種方法分離的白細胞活力較好，但組分較單一，大多只有淋巴細胞，而與紅細胞密度相近的粒細胞被丟棄，且在體外培養時需要添加相關輔助因子。

發明內容

為了克服上述現有技術存在的不足，本發明提供一種全新的魚類白細胞分離方法，該方法使用不含血清的動物細胞培養基就能將白細胞與紅細胞成功分離，并且所分離出的白細胞活性高，很容易體外培養。

本發明的技術方案是提供一種魚類白細胞分離方法，該方法是在無菌條件下，將魚類全血細胞接種到不含動物血清的動物細胞培養基中培養，其中全血細胞接種密度為10⁶-10¹⁰個/毫升培養基，培養條件為15℃-37℃的溫度、90%-98%的濕度和0-8?%的二氧化碳。

所述全血細胞接種密度優選為10⁷~10⁹個/毫升培養基，全血細胞接種密度在此范圍內，白細胞分離的最終結果區別不大。

所述培養條件優選為25℃-30℃的溫度、92%-96%的濕度和3-5?%的二氧化碳。

所述不含動物血清的動物細胞培養基是由培養基干粉組合物和載劑組成，其中培養基干粉組合物的組分及含量為每升培養基包括無水氯化鈣?.2H2O?250.00-270.00?mg、硝酸鐵.9H2O?0.05-0.15?mg、氯化鉀300.00-500.00?mg、無水硫酸鎂95.00-100.00?mg、氯化鈉6300.00-6500.00?mg、無水磷酸二氫鈉108.00-110.00?mg、丁二酸70.00-80.00?mg、丁二酸鈉90.00-110.00?mg、L-鹽酸精氨酸82.00-86.00?mg、L-鹽酸胱氨酸60.00-65.00?mg、甘氨酸20.00-40.00?mg、L-鹽酸組氨酸40.00-44.00?mg、L-異亮氨酸100.00-110.00?mg、L-亮氨酸100.00-110.00?mg、L-鹽酸賴氨酸144.00-148.00?mg、L-甲硫氨酸20.00-60.00?mg、L-苯丙氨酸64.00-68.00?mg、L-絲氨酸38.00-45.00?mg、L-蘇氨酸90.00-100.00?mg、L-色氨酸14.00-18.00?mg、L-酪氨酸70.00-74.00?mg、L-纈氨酸92.00-96.00?mg、D-泛酸鈣2.00-6.00?mg、酒石酸膽堿7.00-7.40?mg、葉酸2.00-6.00?mg、肌醇7.00-7.60?mg、煙酰胺2.00-6.00?mg、核黃素0.20-0.60?mg、鹽酸硫胺2.00-6.00?mg、鹽酸吡哆辛2.00-6.00?mg、葡萄糖800.00-3000.00?mg、丙酮酸鈉100.00-120.00?mg、酚紅9.00-9.60?mg、碳酸氫鈉3500.00-4000.00?mg。