[發明專利]豬圓環病毒2型、豬支原體肺炎二聯滅活疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201310196925.3
• 申請日: 2013-05-24
• 公開（公告）號: CN103263666B
• 公開（公告）日: 2019-07-16
• 發明（設計）人: 陳碩;王勇;王貴華;車艷杰;趙亞榮;汪竹君;馬騰
• 申請（專利權）人: 北京大北農科技集團股份有限公司動物醫學研究中心;北京大北農科技集團股份有限公司;福州大北農生物技術有限公司;北京科牧豐生物制藥有限公司
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61K39/295;A61P31/20;A61P31/04;C12N7/00;C12N1/20
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1.一種豬圓環病毒2型、豬支原體肺炎二聯滅活疫苗，其含有滅活的豬圓環病毒2型抗原和滅活的豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）抗原以及油佐劑，其中，所述的豬肺炎支原體為DJ-166株，保藏號為CGMCC No.4545，所述的油佐劑為Montanide ISA 50V2佐劑。

2.如權利要求1所述的二聯滅活疫苗，其特征在于，所述的滅活的豬肺炎支原體DJ-166株抗原含量不低于10⁹CCU/ml。

3.如權利要求1所述的二聯滅活疫苗，其特征在于，所述的滅活的豬圓環病毒2型抗原的含量不低于10^6.5TCID₅₀/ml。

4.如權利要求1~3任一項所述的二聯滅活疫苗的制備方法，其包括如下步驟：

1）分別增殖濃縮豬圓環病毒2型毒液和豬肺炎支原體菌液；

2）分別滅活豬圓環病毒2型濃縮毒液和豬肺炎支原體濃縮菌液；

3）制備油相：將Montanide ISA 50V2佐劑裝入滅菌瓶內，121℃滅菌30分鐘；

4）制備水相：用步驟2）的滅活PCV2濃縮毒液稀釋步驟2）的滅活Mhyo濃縮菌液，使水相中PCV2抗原含量至少為10^6.3TCID₅₀/ml、Mhyo抗原含量為300~350μg/ml；

5）乳化：將水相成分與油相成分按 1:1 配比乳化，先將油相加入剪切機內，2000r/min攪拌的同時緩緩加入水相，再以5000r/min攪拌30分鐘，終止攪拌前加入1.0%硫柳汞溶液，使其終濃度為0.01%。

5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的豬圓環病毒2型的增殖方法包括如下步驟：

1）將豬圓環病毒2型用生長液作1:3稀釋，然后按5%（V/V）的比例接種已長滿80%-100%單層PK-15A細胞，37℃吸附30分鐘，加入細胞維持液37℃培養72小時；

2）豬圓環病毒2型的濃縮及純化：倒掉細胞維持液，加入1/10細胞維持液體積的0.01mo1/L PBS，置-15℃/室溫反復凍融后收獲，3000r/min離心20分鐘，取上清，豬圓環病毒2型DNB-SX07株毒種每1ml病毒含量應不低于10^6.2 TCID₅₀；

所述生長液為含有8%新生牛血清的MEM營養液，所述維持液為含有2%新生牛血清的MEM營養液。

6.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的豬肺炎支原體增殖濃縮方法包括如下步驟：

1）豬肺炎支原體的增殖：將豬肺炎支原體按10%（V/V）的比例接種豬肺炎支原體液體培養基，37℃培養9日，培養基顏色變黃，pH降至6.8時收獲菌液；

2）豬肺炎支原體的濃縮及純化：用超濾膜系統將豬肺炎支原體菌液進行濃縮，使豬肺炎支原體菌液濃度達到10¹¹~10¹²CCU/ml；將濃縮后的菌液低速離心棄沉淀；將上清高速離心，棄上清，沉淀用pH值7.2 Tris-NaCl緩沖液懸浮，反復3次，最后用pH值7.2的Tris-NaCl緩沖液重懸至原體積1%。

7.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的豬圓環病毒2型滅活方法包括如下步驟：將濃縮的病毒液按1:4000（V/V）的比例加入β-丙內酯，在2~8℃下持續24小時，期間每4小時振搖1次，再經37℃水解2小時，滅活終止。

8.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述豬肺炎支原體滅活方法包括如下步驟：在濃縮的菌液中加入濃度1.0%硫柳汞溶液，使菌液中硫柳汞的濃度達到0.01%，在2~8℃下持續滅活12小時，期間振搖2次，再經超聲裂解4分鐘，滅活終止。

9.權利要求1~3任一項所述的二聯滅活疫苗在制備治療豬圓環病毒2型和/或豬肺炎支原體引起的疾病的藥物中的應用。