[發明專利]一種利用天津短桿菌和植物乳桿菌混合發酵高產GABA的方法

有效

• 申請號: 201310196284.1
• 申請日: 2013-05-24
• 公開（公告）號: CN103243128A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 饒志明;孫紅梅;李秀鵬;徐美娟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12R1/25;C12R1/13
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

一種利用安全高效的天津短桿菌和植物乳桿菌混合發酵高產GABA的方法，屬于發酵工程和酶工程領域。

技術背景

γ-氨基丁酸(GABA)是天然存在于某些生物體的非蛋白質氨基酸，是哺乳動物中樞神經系統重要的抑制性神經遞質，在食品、飼料、醫藥等領域具有廣泛的應用。γ-氨基丁酸具有抗焦慮、降血壓、鎮定安神、增強記憶、調節激素分泌、促進生殖、利尿，鎮痛等生理功能。

γ-氨基丁酸的制備主要通過化學合成法和生物法。其中生物法又包括植物富集法和微生物發酵法。化學法主要是通過鄰苯二甲酞亞氨鉀和γ-氯丁氰在強烈條件下(180℃)反應，然后產物與濃硫酸水解得到；另一種方法是以吡咯烷酮作為原料，經氫氧化鈣、碳酸氫銨水解制得γ-氨基丁酸。總體而言，化學合成法雖然具有反應迅速的優點，但是反應條件苛刻、能耗大、成本高、得率低，反應條件劇烈，污染嚴重，存在著一定的安全隱患。植物富集主要是利用內源性谷氨酸脫羧酶(EC4.1.1.15)催化谷氨酸制備γ-氨基丁酸。這是植物組織對外界條件的應激反應。這些外界應激條件包括溫度、壓力、研磨、破碎、酸堿性以及鈣離子濃度和氧濃度等。植物富集γ-氨基丁酸雖然制備工藝簡單，環境副作用小，但是植物富集γ-氨基丁酸含量較低，不適于規模化生產γ-氨基丁酸。

目前，γ-氨基丁酸的生產主要是微生物發酵法，通過微生物中的谷氨酸脫羧酶催化L-谷氨酸的α-羧基脫羧來生產γ-氨基丁酸。谷氨酸脫羧酶是作用于這一過程的唯一酶，已經在細菌、古生菌和真菌微生物中發現了谷氨酸脫羧酶的存在。微生物發酵法是以谷氨酸或其鈉鹽或含谷氨酸的物質為原料，利用酵母菌、乳酸菌和曲霉菌等食品安全級微生物發酵制得，具有良好的開發前景。利用微生物將谷氨酸脫羧轉化成γ-氨基丁酸具有高度專一性，且發酵法反應條件溫和、反應速率快、設備簡單、公害少、安全、成本較低等優點。利用微生物轉化合成γ-氨基丁酸的研究并將其產業化具有現實需求性。

傳統的微生物發酵需要添加外源的谷氨酸或谷氨酸鈉鹽作為底物，而谷氨酸也是需要以糖質為原料經微生物發酵，采用等電點提取加上離子交換樹脂分離的方法而制得。所以添加外源谷氨酸為底物在一定程度上增加了γ-氨基丁酸的制備成本。天津短桿菌SW07-1是一株谷氨酸生產菌的變異株，保存于江南大學生物工程學院(《生物加工過程》，2009年第7卷第6期74-78頁)。該菌株缺少γ-氨基丁酸合成途徑，但能高效轉化葡萄糖為谷氨酸。另外，本研究室前期經誘變篩選獲得一株植物乳桿菌(Lactobacillus?plantarum)GB01-21(中國典型培養物保藏中心保藏，菌種保藏號：CCTCCM209102)，此菌株缺少谷氨酸合成途徑，但具有較高的谷氨酸脫羧酶活力，能高效催化γ-氨基丁酸的合成。在此基礎上，本發明建立了一個有效的轉化體系，前期利用天津短桿菌SW07-1進行谷氨酸發酵，再利用植物乳桿菌GB01-21將發酵液中的谷氨酸轉化為γ-氨基丁酸，減少底物谷氨酸的添加量，節約了γ-氨基丁酸的制備成本。

發明內容

本發明的目的是利用相對廉價的葡萄糖為原料，通過兩步發酵連續發酵生產γ-氨基丁酸，即第一步采用谷氨酸生產菌株將葡萄糖轉化為谷氨酸，第二步采用全細胞轉化的方法，將能產生谷氨酸脫羧酶的菌株添加到谷氨酸發酵液，建立穩定的轉化體系，催化谷氨酸脫羧形成γ-氨基丁酸，為微生物發酵法生產γ-氨基丁酸提供了一個新思路以及一個切實可行的新工藝，從而可以降低γ-氨基丁酸的生產成本。

本發明的技術方案：本發明提供了一種利用天津短桿菌SW07-1和植物乳桿菌GB01-21混合發酵高產γ-氨基丁酸的方法。首先利用天津短桿菌SW07-1將葡萄糖轉化為谷氨酸，再通過植物乳桿菌GB01-21將上步發酵液中的谷氨酸轉化為γ-氨基丁酸。具體過程為先將第一步谷氨酸發酵所得發酵液的pH調到谷氨酸脫羧酶的最適pH，添加緩沖成分，構成穩定的轉化體系；再將第二步發酵液經過濾或者離心的方法得到谷氨酸脫羧酶生產菌株植物乳桿菌GB01-21的菌體，將其添加到谷氨酸發酵液轉化體系中進行全細胞轉化。

實現本發明方法的步驟如下：