[發明專利]一種高效分離臍帶間充質干細胞的方法

有效

• 申請號: 201310196252.1
• 申請日: 2013-05-24
• 公開（公告）號: CN103421739A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 韓之海;王濤
• 申請（專利權）人: 北京漢氏聯合生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/44;A61P37/00
• 代理公司: 北京國帆知識產權代理事務所(普通合伙) 11334
• 代理人: 李增朝

技術領域

本發明屬于間充質干細胞的分離、培養的方法，特別涉及一種人臍帶間充質干細胞的分離、制備的方法。

背景技術

間充質干細胞（mesenchymal?stem?cells，MSCs）是來源于發育早期中胚層和外胚層的一類多能干細胞，最初在骨髓中發現，因其具有以下特點：1)造血支持作用。作為造血微環境主要細胞成分——基質細胞系的干/祖細胞，MSCs與造血干細胞共同移植可促進造血干祖細胞的植入。2)免疫調控。MSCs不表達CD80，CD86，HLA-DR等協同刺激分子，體外可抑制混合淋巴細胞反應，對于預防和治療異基因造血細胞移植后引起的移植物抗宿主病，治療自身免疫系統疾病有重要意義。3)基因治療。由于MSCs體外擴增、增殖能力強，可以作為基因操作的干細胞平臺，加之MSC具有對腫瘤的靶向性，在腫瘤的基因治療中有著十分誘人的前景。4)多向分化潛能。在體外特定的誘導條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于組織工程。

臍帶是連接胎兒與胎盤間的索狀結構,外包被羊膜,內含黏液性的結締組織，該結締組織內有臍動脈和臍靜脈。血管周圍被黏蛋白樣組織所包裹,后者被稱為華通氏膠(Wharton′s?jelly),它富含透明質酸,形成了成纖維細胞周圍的水凝膠結構。目前已有眾多研究組從臍帶中分離出能形成成纖維細胞集落形成單位（CFU-F）的細胞，這些細胞符合國際細胞治療協會（The?International?Society?for?Cellular?Therapy，ISCT）制定的最低標準【Cytotherapy(2006)Vol.8,No.4,315-317】：（1）貼壁（塑料材質培養器皿）生長能力；（2）細胞表型：應該表達的一類表型CD73、CD90和CD105必須陽性，陽性率不低于95％；同時為了確保MSC中沒有混雜原代分離培養物中存在的一些細胞，選取一組已知的MSC不表達的表型做為輔助的排查標準，CD34（造血祖細胞和內皮細胞標記）、CD45（白細胞標記）、CD14/CD11b（單核細胞和巨噬細胞標記）、CD79α/CD19（B細胞標記）和HLA-DR陰性，陽性率不高于2％；（3）多向分化潛能，包括向骨、軟骨、脂肪分化的能力。

目前的研究結果顯示，臍帶組織中的間充質干細胞主要分布在：①臍帶血管周（perivascular）：Covas等【Braz?J?Med?Biol?Res.2003;36(9):1179-83】從人臍帶血管內皮和內皮下分離出形態學和免疫表型類似于BM-MSC的細胞,并表現出多向分化潛能；②華通氏膠（Wharton’s?Jelly）：Wang等【Stem?Cells.2004;22(7):1330-7.】在華通氏膠中發現了一種細胞,具有出較高的分化潛能,可向多個方向進行分化。這兩種細胞均為間充質干細胞，同樣具有多向分化能力，同樣具有免疫調節活性。

目前，已經有多個單位申請了臍帶間充質干細胞分離的專利，這些專利從臍帶中獲得間充質干細胞的方法多為用膠原酶或混合酶消化而獲得（ZL201010605542.3、ZL200510015492.2、ZL200610067537.5、ZL200810102035.0、ZL200910157731.6），或者是組織塊貼壁法(ZL200910242375.8)。這些方法的一個共同特點是需要將臍帶組織通過機械力破碎。由于產婦大部分生產方式為順產，在生產過程中，尤其是順產過程中會導致臍帶外表攜帶細菌等微生物。雖然在分離臍帶間充質干細胞過程前會對臍帶進行清洗，但這并不能完全去除臍帶表面攜帶的細菌等微生物，在機械力破碎臍帶的過程會導致分離的細胞被污染。目前，國內外已經建立了多個臍帶間充質干細胞庫，對每個保存臍帶間充質干細胞的儲戶來說，干細胞資源是獨一無二的，細胞污染是很難被接受的，所以開發新的工藝迫在眉睫。

發明內容

有鑒于此，本發明的主要目的在于一種簡單、高效分離臍帶間充質干細胞的方法；所述的臍帶間充質干細胞主要來自臍靜脈血管內皮下層，屬于血管周部分。

本發明的技術方案概述如下：

一種臍帶源間充質干細胞的制備方法，其特征是由下述步驟組成：