[發(fā)明專利]一種高效分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310196252.1
• 申請(qǐng)日: 2013-05-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103421739A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓之海;王濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京漢氏聯(lián)合生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775;A61K35/44;A61P37/00
• 代理公司: 北京國(guó)帆知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11334
• 代理人: 李增朝

1.一種分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離：將兩頭結(jié)扎的臍帶組織用無(wú)菌等滲溶液清洗，從一端結(jié)扎處內(nèi)側(cè)1-2厘米處剪斷，從斷端的臍靜脈插入無(wú)菌管子，并使得無(wú)菌管子在臍帶外留出2厘米以上，在臍帶斷端內(nèi)側(cè)1-2厘米左右處固定臍帶與管子，從外側(cè)預(yù)留管子處注入無(wú)菌等滲溶液5-20毫升清洗臍靜脈，清洗2次以上；再?gòu)墓茏幼⑷?0-25毫升trypLE^TM酶溶液，37℃消化0.3-0.5小時(shí)，排出消化液；然后，用無(wú)菌等滲溶液清洗一次；再次從管子注入5-20毫升trypLE^TM酶溶液，37℃消化0.5-1小時(shí)，收集第二次消化后的消化液，將消化液用濾網(wǎng)過(guò)濾得到單細(xì)胞為主的懸液；將細(xì)胞懸液離心，即得到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；

（2）臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：將上述步驟（1）獲得的細(xì)胞按0.5-2×10⁴/cm²的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置于37℃、飽和濕度、5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)到80-90%融合時(shí)，用trypLE^TM消化，按分種率1：2--1：10接種到新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)數(shù)次傳代，間充質(zhì)干細(xì)胞得到純化，可以將細(xì)胞作為原代傳代細(xì)胞庫(kù)凍存到液氮中長(zhǎng)期保存。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（1）中無(wú)菌等滲溶液為與人體體液等滲的無(wú)菌溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步驟（1）中無(wú)菌等滲溶液為生理鹽水、磷酸鹽緩沖液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（2）中所述的培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中傳代次數(shù)為1-5代。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（2）中凍存所用的凍存保護(hù)液含5-10%的DMSO和1-10%的人血清白蛋白和適量DMEM/F12。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（2）中凍存所用的凍存保護(hù)液為商業(yè)化的凍存保護(hù)液。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（2）中合格的原代傳代細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞為經(jīng)過(guò)染色體核型檢查，細(xì)菌、真菌和病毒的病原微生物檢查，細(xì)胞純度鑒定，細(xì)胞生物學(xué)功能鑒定均需合格的干細(xì)胞。

9.一種如權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)所述的方法獲得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

10.如權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)所述的方法獲得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程、制備治療免疫系統(tǒng)疾病的藥物以及組織再生修復(fù)中的應(yīng)用。