[發明專利]一種乳腺癌干細胞的培養方法

無效

• 申請號: 201310195878.0
• 申請日: 2013-05-23
• 公開（公告）號: CN103266083A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發明（設計）人: 鄧濤;趙西娟;魏薇;魏麗婉;高天權
• 申請（專利權）人: 成都美進生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/095
• 分類號: C12N5/095
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種細胞的培養方法，特別涉及一種乳腺癌干細胞的培養方法。

背景技術

全世界每年約有120萬婦女患乳腺癌，50萬死于乳腺癌。在西歐、北美等發達國家，乳腺癌發病率占女性惡性腫瘤首位。相關資料顯示，西方婦女乳腺癌的發病人數高峰期為50～55歲，而且隨著年齡的增長，發病率也不斷提高。

與發達國家相比，中國雖屬乳腺癌的低發區，卻是乳腺癌發病率增長最快的國家之一，中國抗癌協會公布的統計數字顯示，我國近年來乳癌發病率正以每年3%的速度遞增，近5年增長了3倍，成為城市中死亡率增長最快的癌癥之一。其中，近十年來，中國主要城市乳腺癌發病率增長了37%，死亡率增長了38.9%，農村死亡率增長了39.7%。此外，中國女性的乳腺癌發病年齡，要比西方女性小10歲左右，且大城市女性乳腺癌發病率有逐步接近歐美發達國家水平的趨勢，發病年齡也呈年輕化發展。

乳腺癌具有侵襲性和難治愈的特點,治療后仍有可能復發或轉移,而其起源、復發與轉移的真正原因可能是存在于乳腺癌內極少數具有干細胞的自我更新能力和多向分化潛能的細胞群，即乳腺癌干細胞，這些細胞具有化療、放療及缺氧抵抗性，同時具有高致瘤性、高侵襲轉移性，在乳腺癌的發生﹑發展乃至轉移﹑復發中起著極其重要作用。然而，放療和化療對存在于腫瘤中數量較少的干細胞樣細胞群療效甚微，經過治療后殘存的乳腺癌干細胞的增殖足以促使乳腺癌復發和轉移。

研究表明，CD44+CD24-是致瘤性乳腺癌干細胞最基本的表型標記，此類細胞亞群在乳腺癌中起著干細胞樣作用，與乳腺癌侵襲、歸巢和轉移密切相關。因此，開發以乳腺癌干細胞為靶點的新一代抗腫瘤生物及免疫藥物成為了根治乳腺癌的發展方向之一。然而，由于乳腺癌干細胞在乳腺癌組織中的比例只有1%左右，因此如何分離獲得有效的乳腺癌干細胞，并在體外進行大規模擴增培養，建立乳腺癌干細胞系，成為了乳腺癌干細胞技術發展的瓶頸。

現有技術中的培養方法，培養基中所用的EGF的用量一直很大，使成本費用一直居高不下。

發明內容

本發明提出了一種乳腺癌干細胞的培養方法，解決了現有技術中的不足，本發明提供的乳腺癌干細胞擴增培養的方法，在培養基中添加的EGF用量明顯減少，降低了培養費用，并且不影響乳腺癌干細胞的生長。

本發明的技術方案是這樣實現的：一種乳腺癌干細胞的培養方法，它包括以下步驟：

（1）分析細胞分離所得乳腺癌干細胞球的CD44+CD24-乳腺癌干細胞純度：

將乳腺癌干細胞球洗滌，計數后，用100μl含有2.0%HIBS的平衡鹽溶液重懸1x10⁶腺癌細胞，制備成單細胞懸液，并加入20μl抗CD44-APC和1μg抗CD24-FITC，在0-4℃下孵育25-35分鐘后用含2%HIBS的平衡鹽溶液洗滌；將含有20μl活性染料7AAD、含有2%HIBS的平衡鹽溶液加入，染色、然后洗滌、重懸染色細胞，并用細胞濾器過濾，以去除死細胞和細胞結團；最后計算活細胞數與細胞總數的百分比，并采用經流式細胞儀分析CD44+CD24-乳腺癌干細胞的純度。

上述的計算活細胞數與細胞總數的方法為將非粘附培養前后分別取10ul細胞懸液，再分別與10ul0.4%臺盼藍溶液混合后，滴入細胞計數板上，并置于倒置顯微鏡下觀察活細胞狀況，不著色，發亮的為活細胞；著色細胞則為死細胞，從而計算活細胞數與細胞總數的百分比。

（2）將CD44+CD24-乳腺癌干細胞純度大于68%的乳腺癌干細胞球進行無血清非粘附擴增培養：

將細胞分離所得的乳腺癌干細胞球收集，然后在400-600rpm下離心，去上清后，加入1x0.25%胰蛋白酶-EDTA，室溫下，機械消化分離腫瘤細胞球0.5-1.5分鐘，平衡鹽溶液緩沖液終止消化，并用25G針作用于乳腺癌腫瘤細胞球，輕輕吹打使細胞分散成單個細胞，最后將分離出來的單個細胞種植于培養板中進行擴增培養，用含有bFGF、EGF、胰島素和牛血清白蛋白的DMEM/F-12HAM培養基進行培養。

上述步驟（2）中的DMEM/F-12HAM培養基中bFGF的含量為8-12ng/mL，EGF的含量為18-22ng/mL，胰島素的含量為3-7μg/mL，牛血清白蛋白的含量為0.2-0.6%；步驟（2）中采用DMEM/F-12HAM培養基培養時的培養條件為：在溫度為35-39℃，3-7%CO₂中培養，且每周更換培養基2-3次；步驟（2）中所使用的培養板為6孔超低粘附培養板或24孔超低粘附培養板。