[發明專利]一種乳腺癌干細胞的培養方法

無效

• 申請號: 201310195878.0
• 申請日: 2013-05-23
• 公開（公告）號: CN103266083A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發明（設計）人: 鄧濤;趙西娟;魏薇;魏麗婉;高天權
• 申請（專利權）人: 成都美進生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/095
• 分類號: C12N5/095
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種乳腺癌干細胞的培養方法，其特征在于：它包括以下步驟：

（1）分析細胞分離所得乳腺癌干細胞球的CD44+CD24-乳腺癌干細胞純度；

（2）將CD44+CD24-乳腺癌干細胞純度大于68%的乳腺癌干細胞球進行無血清非粘附擴增培養。

2.根據權利要求1所述的一種乳腺癌干細胞的培養方法，其特征在于：所述步驟（1）中分析細胞分離所得乳腺癌干細胞球的CD44+CD24-乳腺癌干細胞純度的方法為：將乳腺癌干細胞球洗滌，計數后，用100μl含有2%HIBS的平衡鹽溶液重懸1x10⁶乳腺癌細胞，制備成單細胞懸液，并加入20μl抗CD44-APC和1μg抗CD24-FITC，在0-4℃下孵育25-35分鐘后用含2%HIBS的平衡鹽溶液洗滌；將含有20μl活性染料7AAD、含有2%HIBS的平衡鹽溶液加入，染色、然后洗滌、重懸染色細胞，并用細胞濾器過濾，以去除死細胞和細胞結團；最后計算活細胞數與細胞總數的百分比，并采用經流式細胞儀分析CD44+CD24-乳腺癌干細胞的純度。

3.根據權利要求2所述的一種乳腺癌干細胞的培養方法，其特征在于：所述計算活細胞數與細胞總數的方法為將非粘附培養前后分別取10ul細胞懸液，再分別與10ul0.4%臺盼藍溶液混合后，滴入細胞計數板上，并置于倒置顯微鏡下觀察活細胞狀況，不著色，發亮的為活細胞；著色細胞則為死細胞，從而計算活細胞數與細胞總數的百分比。

4.根據權利要求3所述的一種乳腺癌干細胞的培養方法，其特征在于：所述步驟（2）中擴增培養乳腺癌干細胞球的方法為：將細胞分離所得的乳腺癌干細胞球收集，然后然后在400-600rpm下離心，去上清后，加入1x0.25%胰蛋白酶-EDTA，室溫下，機械消化分離腫瘤細胞球0.5-1.5分鐘，平衡鹽溶液緩沖液終止消化，并用25G針作用于乳腺癌腫瘤細胞球，輕輕吹打使細胞分散成單個細胞，最后將分離出來的單個細胞種植于培養板中進行擴增培養，用含有bFGF、EGF、胰島素和牛血清白蛋白的DMEM/F-12HAM培養基進行培養。

5.根據權利要求4所述的一種乳腺癌干細胞的培養方法，其特征在于：所述步驟（2）中的DMEM/F-12HAM培養基中bFGF的含量為8-12ng/mL，EGF的含量為18-22ng/mL，胰島素的含量為3-7μg/mL，牛血清白蛋白的含量為0.2-0.6%。

6.根據權利要求5所述的一種乳腺癌干細胞的培養方法，其特征在于：所述步驟（2）中的DMEM/F-12HAM培養基中bFGF的含量為10ng/mL，EGF的含量為20ng/mL，胰島素的含量為5μg/mL，牛血清白蛋白的含量為0.4%。

7.根據權利要求6所述的一種乳腺癌干細胞的培養方法，其特征在于：所述步驟（2）中采用DMEM/F-12HAM培養基培養時的培養條件為：在溫度為37℃，5%CO₂中培養，且每周更換培養基2-3次。

8.根據權利要求7所述的一種乳腺癌干細胞的培養方法，其特征在于：所述步驟（2）中所使用的培養板為6孔超低粘附培養板或24孔超低粘附培養板。

9.根據權利要求8所述的一種乳腺癌干細胞的培養方法，其特征在于：所述步驟（2）中擴增培養乳腺癌干細胞球，在擴增培養中自乳腺癌干細胞球培養至第三代時，培養基中EGF用量為8-12ng/ml。