[發明專利]一種乳腺癌干細胞的分離方法

有效

• 申請號: 201310195721.8
• 申請日: 2013-05-23
• 公開（公告）號: CN103243075A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 鄧濤;趙西娟;魏薇;魏麗婉;高天權
• 申請（專利權）人: 成都美進生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/095
• 分類號: C12N5/095
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種細胞的分離，具體涉及一種乳腺癌干細胞的分離方法。

背景技術

全世界每年約有120萬婦女患乳腺癌，50萬死于乳腺癌。在西歐、北美等發達國家，乳腺癌發病率占女性惡性腫瘤首位。相關資料顯示，西方婦女乳腺癌的發病人數高峰期為50～55歲，而且隨著年齡的增長，發病率也不斷提高。

與發達國家相比，中國雖屬乳腺癌的低發區，卻是乳腺癌發病率增長最快的國家之一，中國抗癌協會公布的統計數字顯示，我國近年來乳癌發病率正以每年3%的速度遞增，近5年增長了3倍，成為城市中死亡率增長最快的癌癥之一。其中，近十年來，中國主要城市乳腺癌發病率增長了37%，死亡率增長了38.9%，農村死亡率增長了39.7%。此外，中國女性的乳腺癌發病年齡，要比西方女性小10歲左右，且大城市女性乳腺癌發病率有逐步接近歐美發達國家水平的趨勢，發病年齡也呈年輕化發展。

乳腺癌具有侵襲性和難治愈的特點,治療后仍有可能復發或轉移,而其起源、復發與轉移的真正原因可能是存在于乳腺癌內極少數具有干細胞的自我更新能力和多向分化潛能的細胞群，即乳腺癌干細胞，這些細胞具有化療、放療及缺氧抵抗性，同時具有高致瘤性、高侵襲轉移性，在乳腺癌的發生﹑發展乃至轉移﹑復發中起著極其重要作用。然而，放療和化療對存在于腫瘤中數量較少的干細胞樣細胞群療效甚微，經過治療后殘存的乳腺癌干細胞的增殖足以促使乳腺癌復發和轉移。

研究表明，CD44+CD24-是致瘤性乳腺癌干細胞最基本的表型標記，此類細胞亞群在乳腺癌中起著干細胞樣作用，與乳腺癌侵襲、歸巢和轉移密切相關。因此，開發以乳腺癌干細胞為靶點的新一代抗腫瘤生物及免疫藥物成為了根治乳腺癌的發展方向之一。然而，由于乳腺癌干細胞在乳腺癌組織中的比例只有1%左右，因此如何分離獲得有效的乳腺癌干細胞，并在體外進行大規模擴增培養，建立乳腺癌干細胞系，成為了乳腺癌干細胞技術發展的瓶頸。

目前，主要采用密度梯度離心法、流式細胞分選法和免疫磁珠分選法來分離乳腺癌干細胞，三者均有利弊。密度梯度離心法分離的乳腺癌干細胞純度和細胞活性不高；流式細胞分選法所需儀器設備的費用昂貴，操作過程復雜，需要專業技術人員進行操作；免疫磁珠分選法初次分選的乳腺癌干細胞純度較低，需進一步純化。

免疫磁珠法分離法是基于細胞表面抗原能與連接在磁珠上的特異性單克隆抗體相結合，在外磁場作用下，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面標記抗原的細胞由于不能與相連著磁珠的特異性單抗結合而沒有磁性，因此不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。免疫磁珠分離法有陽性分選法和陰性分選法，陽性分選法的磁珠結合的細胞是所要分離獲得的細胞，而陰性分離法的磁珠結合的細胞為不需要細胞。免疫磁珠分離法初次獲得的靶細胞純度不高，因此需要對靶細胞進一步富集純化。

由于腫瘤干細胞既能發生對稱性分裂，引起腫瘤干細胞的自我更新，也能發生非對稱性分裂產生干細胞與祖細胞，后者可進一步分化成后代細胞。因此如何使分選出來的乳腺癌上皮細胞富集更多的乳腺癌干細胞，并且保證干細胞只發生對稱性分裂而不發生或少量發生分化，是研究人員一直致力研究的課題。

發明內容

本發明提出了一種乳腺癌干細胞的分離方法，解決了現有技術中的不足，該分離方法所獲得的細胞表面因不含有抗體和磁珠的干擾；而且可保證乳腺癌細胞的分離效率及其乳腺癌干細胞富集后的純度；不僅能高效分離數量較少的乳腺癌上皮細胞，而且縮短了分離時間，降低了分離成本，安全有效。

本發明的技術方案是這樣實現的：一種乳腺癌干細胞的分離方法，采用胸腔穿刺手術收集的胸水進行乳腺癌干細胞的分離，將采集的胸水在2-4小時之內處理，具體步驟如下：

（1）制備胸水單細胞懸液：

在轉速為400-600rpm下離心胸腔穿刺手術收集的胸水，以最大程度減少對細胞的損傷，并充分收集目標細胞；用含有1.5-2.5%熱滅活的胎牛血清和2mmol/L的Hank平衡鹽溶液洗滌細胞碎片后離心，加入紅細胞裂解液Tris-NH₄Cl裂解紅細胞，將紅細胞裂解后，再用2mmol/L的Hank平衡鹽溶液洗滌，離心，去除上清；

由于乳腺癌胸水轉移大多為血性，含大量紅細胞，其紅細胞含量往往超過StemSepTM(StemCell?Technologies)的純化能力，因此可用紅細胞裂解液（Tris-NH₄Cl）將離心洗滌后的細胞碎片中的紅細胞裂解，再用Hank平衡鹽溶液洗滌細胞碎片，所得到的乳腺癌組織細胞中不含紅細胞，可進一步用于后續乳腺癌干細胞的分選；