[發(fā)明專利]一種乳腺癌干細胞的分離方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310195721.8
• 申請日: 2013-05-23
• 公開（公告）號: CN103243075A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄧濤;趙西娟;魏薇;魏麗婉;高天權(quán)
• 申請（專利權(quán)）人: 成都美進生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/095
• 分類號: C12N5/095
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種乳腺癌干細胞的分離方法，其特征在于：它包括以下步驟：

（1）制備胸水單細胞懸液；

（2）免疫磁珠陰性分選，分離去除非乳腺癌細胞，得乳腺癌上皮細胞液；

（3）采用非粘附培養(yǎng)法將步驟（2）得到的乳腺癌上皮細胞液進行富集純化，然后得乳腺癌干細胞球。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳腺癌干細胞的分離方法，其特征在于：所述步驟（1）為：離心胸腔穿刺手術(shù)收集的胸水，充分收集目標細胞；用含有熱滅活的胎牛血清和平衡鹽溶液洗滌細胞碎片后離心，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，將紅細胞裂解后，再用平衡鹽溶液洗滌，離心，去除上清。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種乳腺癌干細胞的分離方法，其特征在于：所述離心胸腔穿刺手術(shù)收集的胸水的轉(zhuǎn)速為400-600rpm；所述胎牛血清的熱滅活含量為1.5-2.5%。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種乳腺癌干細胞的分離方法，其特征在于：所述平衡鹽溶液為1.5-2.5mmol/L的Hank平衡鹽溶液；所述紅細胞裂解液為Tris-NH₄Cl。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種乳腺癌干細胞的分離方法，其特征在于：所述步驟（2）為：用MACS緩沖液重懸細胞，過100μm濾網(wǎng)得到懸浮單細胞，調(diào)整細胞密度至5x10⁶-1x10⁹/ml，將生物素標記的人造血細胞抗體，CD2,14,16,38,45,66和血型糖蛋白A加入步驟（1）得到的單細胞懸液中，于0-4℃下孵育25-35分鐘后，加入50-70μl免疫磁珠，混勻，于0-4℃下再孵育25-35分鐘，用MACS緩沖液洗滌細胞兩次，離心去除多余的免疫磁珠，再用MACS緩沖液重懸細胞；再用MACS緩沖液預(yù)洗磁性分選柱，將細胞懸液過柱，收集通過分選柱的細胞液，該細胞液為乳腺癌上皮細胞液。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種乳腺癌干細胞的分離方法，其特征在于：所述生物素標記的人造血細胞抗體，CD2,14,16,38,45,66和血型糖蛋白A加入步驟（1）得到的單細胞懸液中，加入的每一種抗體比例按20μl抗體相對于5x10⁷細胞/100μl細胞懸液，所述血型糖蛋白A按22-27μg/ml加入到單細胞懸液中。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種乳腺癌干細胞的分離方法，其特征在于：所述步驟（3）中進行富集純化乳腺癌上皮細胞液的方法為：將步驟（2）中得到的乳腺癌上皮細胞液進行離心，用平衡鹽溶液洗滌后，種植在培養(yǎng)板里，用含有bFGF、EGF、胰島素和牛血清白蛋白的DMEM/F-12HAM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)兩周，腫瘤細胞呈球狀生長，得乳腺癌干細胞球。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種乳腺癌干細胞的分離方法，其特征在于：所述離心分離后得到的乳腺癌上皮細胞液的轉(zhuǎn)速為400-600rpm。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種乳腺癌干細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟（3）中的DMEM/F-12HAM培養(yǎng)基中bFGF的含量為8-12ng/mL，EGF的含量為18-22ng/mL，胰島素的含量為3-7μg/mL，牛血清白蛋白的含量為0.2-0.6%。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種乳腺癌干細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟（3）中采用DMEM/F-12HAM培養(yǎng)基培養(yǎng)時的培養(yǎng)條件為：在溫度為37℃，5%CO₂中培養(yǎng)，且每周更換培養(yǎng)基2-3次；所述步驟（3）中所使用的培養(yǎng)板為6孔超低粘附培養(yǎng)板或24孔超低粘附培養(yǎng)板。