[發明專利]一種提高香蕉未成熟雄花胚性愈傷誘導成功率的方法

有效

• 申請號: 201310192765.5
• 申請日: 2013-05-13
• 公開（公告）號: CN103283597A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 常勝合;舒海燕;李敬陽;許桂鶯;孫佩光;孫威;王甲水;位明明;吳瓊;明建鴻;金志強
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院海口實驗站
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及香蕉體細胞再生方法，尤其指一種通過提高胚性愈傷誘導成功率，獲得胚性懸浮細胞，由胚性懸浮細胞生成香蕉幼苗的方法。

背景技術

在我國香蕉種植過程中，經常會遇到枯萎病、凍害、臺風、采后腐爛等問題。培育多抗高產的新品種是解決這些問題的根本途徑。但是現在生產上推廣的絕大多數栽培香蕉是三倍體。它們單性結實并且雌性高度不育。常規的雜交育種方法在香蕉上運用起來難度很大。非常規育種方法，例如轉基因，是解決香蕉育種難題的一個途徑。但是如果像其它植物轉基因那樣，直接把外植體或者愈傷組織作為轉化對象，轉化后常會因為嵌合體和胚性愈傷所占比例低而導致得到轉基因植株的難度非常大。如果能夠得到單個的胚性細胞，把單個的胚性細胞作為轉化對象，則這些問題都可以得到解決。理論上來說，胚性懸浮細胞系里邊的細胞是各自分離的。它們與農桿菌或銀彈接觸的概率很高。轉基因成功的幾率得到提高。每一個胚性細胞能夠形成一個植株。將來長成的每一個植株也都來自于一個單獨的胚性細胞。轉基因后得到的植株將不存在嵌合體的問題。建立一個穩定均一的胚性懸浮細胞系是進行香蕉轉基因工作的前提。誘導胚性愈傷是建立胚性懸浮細胞系的第一步。但是從已經發表的文章來看，由香蕉未成熟雄花誘導出愈傷的幾率比較低，而且這些誘導出的愈傷中只有很小一部分是胚性愈傷，雄花和愈傷容易褐化壞死，香蕉胚性愈傷誘導成功的幾率非常低，只有5％-8％。這意味著誘導香蕉胚性愈傷需要大量的時間和精力。在香蕉未成熟雄花中，位于第十六排到第八排的雄花最適宜于進行胚性愈傷誘導(最靠近尖端分生組織突起的雄花為第一排)。第一排到第八排的雄花在誘導培養基上進行培養的過程中，很容易褐化壞死。然而從理論上來說，未成熟雄花中的細胞是已經高度分化的細胞。得到胚性愈傷組織需要讓它們回到早期的胚性狀態。那些越接近尖端分生組織突起的雄花距離早期的胚性狀態就越近，就越容易被誘導得到胚性愈傷組織。如果未成熟雄花褐化的問題能夠被解決，將很有可能會大幅度提高獲得胚性愈傷和胚性懸浮細胞系的概率，節約人力和物力。所以，提高獲得香蕉胚性愈傷和胚性懸浮細胞系的概率有兩條可能途徑：一，降低愈傷和未成熟雄花在培養過程中的褐化問題；二，提高誘導出的愈傷向胚性愈傷轉化的比例。

發明內容

本發明旨在解決上述問題，提供一種大幅度提高香蕉未成熟雄花胚性愈傷誘導成功率的方法，其能夠使花蕾中第一排到第八排的未成熟雄花在胚性愈傷誘導過程中褐化壞死的比例大幅度降低，并且能夠使多數未成熟雄花成功誘導出胚性愈傷，進而大幅提高胚性懸浮細胞系成功建立的幾率。

為此，本發明的技術方案包括如下步驟：

A、選用目前生產上大面積推廣的、胚性懸浮細胞系較難建立的三倍體香蕉作為出發材料，包括：巴西蕉、威廉斯B6、海蕉一號、Anaikomban、Matti。

B、胚性愈傷的誘導

(1)選取開花后1到10周的雄花花蕾，在無菌條件下剝掉花蕾外面的苞片，直到花蕾大小為0.8cm×2cm，將花蕾放入內壁沾有水珠的塑料盒內，塑料盒用封口膜密封，直到取出花蕾進行表面滅菌；

(2)將上述花蕾從塑料盒內取出，放入70％的酒精中浸泡1分鐘，然后取出放于超凈工作臺上備用；

(3)在超凈工作臺中，將表面滅菌后的花蕾放于直徑為120cm的無菌培養皿中，用鑷子和手術刀片繼續剝離花蕾外面的苞片，直到肉眼看不清雄花為止，然后將花蕾放于解剖鏡下繼續剝離花蕾外面的苞片，直到大約第20排的雄花出現為止；

(4)用手術刀片小心取下第8排到第1排的雄花(最接近分生組織突起的雄花為第1排)，轉入裝有胚性愈傷誘導培養基M1的培養瓶中，將創傷面緊貼培養基；每瓶5到8排雄花；胚性愈傷誘導培養基M1為：1/3MS+4mg/L2，4-D+1mg/L?IAA+1mg/L?NAA+1mg/L?Biotin+30g/L?Sucrose+7g/L?Agar+0.1％ascorbic?acid+10mg/L?AGPs，pH5.8；所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO₃、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量為MS培養基正常用量的1/3，其它元素用量不變；所述2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；IAA即吲哚乙酸；NAA即a-萘乙酸；Biotin即生物素；Sucrose即蔗糖；Agar即瓊脂粉；ascorbic?acid即抗壞血酸；AGPs即阿拉伯半乳糖蛋白；