[發明專利]一種提高香蕉未成熟雄花胚性愈傷誘導成功率的方法

有效

• 申請號: 201310192765.5
• 申請日: 2013-05-13
• 公開（公告）號: CN103283597A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 常勝合;舒海燕;李敬陽;許桂鶯;孫佩光;孫威;王甲水;位明明;吳瓊;明建鴻;金志強
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院海口實驗站
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種提高香蕉未成熟雄花胚性愈傷獲得成功率的方法，其特征在于包括如下步驟：

A.選用目前大面積推廣的香蕉品種或者較難獲得胚性懸浮細胞系的香蕉品種，包括：巴西蕉(Musa?acuminate?AAA?Cavendish?cv.Brazil)、威廉斯B6、海蕉一號、高種天寶蕉、高腳頓地雷、齊尾、河口高把香蕉、仙人蕉、矮腳頓地雷、廣東香蕉2號；

B.胚性愈傷的誘導

1)選取開花后1到10周的香蕉花蕾，在無菌條件下剝掉花蕾外面的苞片，直到花蕾大小為0.8cm×2cm，將花蕾放入內壁沾有水珠的塑料盒內，塑料盒用封口膜密封，直到取出花蕾進行表面滅菌；

2)將上述花蕾從塑料盒內取出，放入70％的酒精中浸泡1分鐘，然后取出放于超凈工作臺上備用；

3)在超凈工作臺中，將表面滅菌后的花蕾放于直徑為120cm的無菌培養皿中，用鑷子和手術刀片繼續剝離花蕾外面的苞片，直到肉眼看不清雄花為止，然后將花蕾放于解剖鏡下繼續剝離花蕾外面的苞片，直到大約第20排的雄花出現為止；

4)用手術刀片小心取下第8排到第1排的雄花，最接近分生組織突起的雄花為第1排，轉入裝有胚性愈傷誘導培養基M1的培養瓶中，將創傷面緊貼培養基；每瓶5到8排雄花；胚性愈傷誘導培養基M1為：1/3MS+4mg/L2，4-D+1mg/L?IAA+1mg/L?NAA+1mg/L?Biotin+30g/L?Sucrose+7g/L?Agar+0.1％ascorbic?acid+10mg/L?AGPs，pH5.8；所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO₃、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量為MS培養基正常用量的1/3，其它元素用量不變；2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；IAA即吲哚乙酸；NAA即a-萘乙酸；Biotin即生物素；Sucrose即蔗糖；Agar即瓊脂粉；ascorbic?acid即抗壞血酸；AGPs即阿拉伯半乳糖蛋白；

5)培養條件：黑暗，溫度28度，培養時間3到5個月；

C.胚性懸浮細胞系的誘導：

1)選擇包含有大量松脆易碎的胚性愈傷和處于發育早期的透明原胚的培養物，小心放于無菌的培養皿中，用手術刀片小心取下松脆易碎的胚性愈傷，放于盛放有6ml液體培養基M2中；液體培養基M2為：MS+1mg/L2，4-D+100mg/Lglutamine+100mg/L?maltose+10mg/L?ascorbic?acid+45g/L?sucrose+10mg/LAG，pH＝5.3；所述2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；glutamine即谷氨酰胺；maltose即麥芽糖；ascorbic?acid即抗壞血酸；sucrose即蔗糖；AG即阿拉伯半乳聚糖；

2)培養條件：黑暗，溫度28度，轉速90rpm，培養時間6到9個月；

3)胚性懸浮細胞系誘發的第一個月，每7到10天更換一次培養液，每次更換時保留10％-20％的原有培養液；從第二個月開始，每兩周更換一次培養液，每次更換時保留10％-20％的原有培養液；在更換培養液時，用移液器吸走并除去黃色的分生組織小球、處于子葉期的白色胚、褐化組織和高度液泡化的細胞；

4)每個月轉移一部分樣品在細菌培養基上培養，以檢測是否被細菌污染；每次更換培養液時，先靜置1分鐘，觀察沉淀下來的細胞所占培養液的比例，如果沉淀細胞的體積所占整個培養液體積的比例超過3％，可以將細胞轉移到一個更大的培養瓶中進行培養；在培養的過程中可以用FDA檢測懸浮細胞的活性，先滴幾滴FDA到蒸餾水中，直到呈現亮藍色，加1到2滴這樣的溶液到懸浮細胞樣品中，在顯微鏡下觀察，呈現亮綠色的細胞為具有活性的細胞；用孔徑為250到500微米的篩網除去分生組織小球和原胚；如此反復，即可獲得較理想的胚性懸浮細胞系；

D.植株再生

1)轉移一部分胚性懸浮細胞到一個帶有刻度的試管內，靜置1分鐘后，觀察細胞體積占培養液體積的比例，添加培養液M2使靜置后細胞體積占培養液的體積為3％；

2)在直徑為90mm的培養皿中盛放25ml再生培養基M3，M3培養基為：SH大量元素+SH微量元素+MS維生素+4.1μmol/L?biotin+680μmol/Lglutamine+2mmol/L?proline+100mg/L?maltose+1.1μmol/L?NAA+0.2μmol/Lzeatin+0.5μmol/L?kinetin+0.7μmol/L?N6-(2-isopentenyl)adenine+130mmol/Lsucrose+29mmol/L?lactose+1g/L?phytagel，pH5.8；所述SH即SH培養基；MS即MS培養基；biotin即生物素；glutamine即谷氨酰胺；proline即脯氨酸；maltose即麥芽糖；NAA即萘乙酸；zeatin即玉米素；kinetin即激動素；adenine即腺嘌呤；sucrose即蔗糖；lactose即乳糖；phytagel即植物凝膠；在培養基的上面鋪上一張定性分析濾紙，轉移1ml上述培養物到濾紙上；

3)黑暗，溫度28度，培養時間為3到4個月；

4)在直徑為90mm的培養皿中盛放25ml再生培養基M4，M4培養基配方為：MS大量元素+MS微量元素+MS維生素+2mg/L?IAA+0.5mg/L?BAP+30g/L?sucrose+3g/L?phytagel，pH＝5，8；所述MS即MS培養基；IAA即吲哚乙酸；BAP即6-芐氨基嘌呤；sucrose即蔗糖；phytagel即植物凝膠；將成熟胚轉移到培養基M4上，培養1到2個月獲得發芽的胚；

5)將發芽的胚轉移到培養基M5上，M5培養基配方為：MS+1μmol/L?IAA+1μmol/L?BAP，pH＝5，8；所述MS即MS培養基；IAA即吲哚乙酸；BAP即6-芐氨基嘌呤；培養1到1.5個月，即可獲得香蕉再生幼苗。