[發(fā)明專利]Apidaecin型抗菌肽在畢赤酵母菌中的表達(dá)及擴(kuò)大培養(yǎng)

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310192617.3
• 申請日: 2013-05-23
• 公開（公告）號: CN103352046A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周建業(yè);趙珺;趙海燕;張煒;陳熙明;溫滿倉;焦康禮
• 申請（專利權(quán)）人: 甘肅智信達(dá)生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 北京中恒高博知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11249
• 代理人: 夏晏平

1.Apidaecin型抗菌肽在畢赤酵母菌中的表達(dá)方法，步驟如下：

（1）、Apidaecin型抗菌肽的修飾；

（2）、構(gòu)建表達(dá)載體；

（3）、酶切重組質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞；

（4）、Apidaecin型抗菌肽的表達(dá)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于：步驟（1）中所述修飾是在5’端加入Kex2信號肽酶的切割識別位點(diǎn)，整個基因前后分別加入XhoI和Not?I位點(diǎn)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于：步驟（3）中所述電擊轉(zhuǎn)化的條件為：電壓為：1.5kv,電擊4ms，電擊一律在冰上進(jìn)行；電擊完畢后，放置于0℃預(yù)冷過的質(zhì)量濃度為60%的山梨醇溶液中。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于：步驟（4）中Apidaecin型抗菌肽的表達(dá)是先用BMGY培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，離心將菌體重懸后，再在搖床上繼續(xù)培養(yǎng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)方法，其特征在于：所述BMGY培養(yǎng)基的配比為：質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2％的蛋白胨，1％的酵母提取物，100mmol/L的磷酸鉀緩沖液，1.34％的酵母氮堿基，0.4μg/mL的維生素H，1％的甘油，其余為ddH₂O；其中，100mmol/L磷酸鉀緩沖液在加入培養(yǎng)基前調(diào)pH至6.0；

?其制備方法為：除維生素H、酵母氮堿基外，將上述試劑依次加入，混勻，滅菌；待培養(yǎng)基冷卻后，加入除菌過濾后的維生素H、酵母氮堿基。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)方法，其特征在于：是用BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD_600?=2-6。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于：所述表達(dá)產(chǎn)物的濃度為40mg/L，純度在95%以上。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)方法，其特征在于：所述重懸是用BMMY培養(yǎng)基菌體；所述BMMY培養(yǎng)基的配方為：2％的蛋白胨，1％的酵母提取物，100mmol/L的磷酸鉀緩沖液，1.34％的酵母氮堿基，0.4μg/mL的維生素H，體積濃度3%無水甲醇，其余為ddH₂O；其中，100mmol/L磷酸鉀緩沖液在加入培養(yǎng)基前調(diào)pH至6.0；

????其制備方法為：除維生素H、酵母氮堿基外，將上述試劑依次加入，混勻，滅菌，待培養(yǎng)基冷卻后，加入除菌過濾后的維生素H、酵母氮堿基。

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)方法，其特征在于：所述在搖床上繼續(xù)培養(yǎng)時，每24h向培養(yǎng)基中添加體積濃度3%無水甲醇；培養(yǎng)96小時后停止培養(yǎng)。

10.畢赤酵母菌在Apidaecin型抗菌肽表達(dá)中的應(yīng)用。