[發(fā)明專利]Apidaecin型抗菌肽在畢赤酵母菌中的表達(dá)及擴(kuò)大培養(yǎng)

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310192617.3
• 申請日: 2013-05-23
• 公開（公告）號: CN103352046A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周建業(yè);趙珺;趙海燕;張煒;陳熙明;溫滿倉;焦康禮
• 申請（專利權(quán)）人: 甘肅智信達(dá)生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 北京中恒高博知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11249
• 代理人: 夏晏平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及Apidaecin型抗菌肽在畢赤酵母菌中的表達(dá)及擴(kuò)大培養(yǎng)。

背景技術(shù)

國家中長期科技發(fā)展綱要重點(diǎn)中，將人類健康與疾病的生物學(xué)基礎(chǔ)列為國家重大戰(zhàn)略需求的基礎(chǔ)研究。自從發(fā)現(xiàn)抗生素以后人類的健康事業(yè)得到了巨大的發(fā)展，然而隨著濫用抗生素導(dǎo)致了大量耐藥菌的出現(xiàn)。所有的常規(guī)抗生素都出現(xiàn)了相應(yīng)的抗藥性致病株系，致病菌的抗藥性問題已經(jīng)日益嚴(yán)重地威脅著人們的健康。尋找全新類型的抗生素是解決抗藥性問題的一條有效途徑。

抗菌肽又叫抗微生物肽、抗生素肽，是生物界中廣泛存在的一類生物活性小肽。這類生物活性小肽是非專一性的免疫應(yīng)答產(chǎn)物，具有廣譜抗菌作用。它不僅能抗多種細(xì)菌或真菌，而且還抗原蟲、病毒或腫瘤細(xì)胞。對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌均有抑殺作用，最重要的是可以殺傷動物體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，卻又不破壞動物體內(nèi)的正常細(xì)胞[1]。迄今，已在許多生物包括動物（昆蟲、鳥類等）、植物及原核生物中發(fā)現(xiàn)600多種內(nèi)源性抗菌活性肽，其中許多抗菌肽的cDNA已被克隆測序，并對某些抗菌肽基因進(jìn)行了初步的基因定位和表達(dá)調(diào)控的研究[2]。近幾年來，有關(guān)抗菌肽及其應(yīng)用已逐漸成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)、生理學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，在醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品工業(yè)等都有廣泛的應(yīng)用及前景。

Apidaecin型抗菌肽指由昆蟲細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)的一類小的、富含脯氨酸?(Pro)?的、長度為18-20個氨基酸的抗菌肽。結(jié)構(gòu)分析表明，Apidaecin含有兩個活性區(qū)域，即決定抗菌肽抗菌活性的保守區(qū)和決定抗菌肽抗菌譜的可變區(qū)。Apidaecin為由基因編碼的沒有經(jīng)過翻譯后修飾的抗菌肽，其主要對一些革蘭氏陰性菌具有抑菌活性。Apidaecin發(fā)揮抑菌活性的機(jī)制包括以下幾步：首先Apidaecin非特異性地結(jié)合于細(xì)菌細(xì)胞外膜的脂多糖?(LPS)?，隨后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)外膜之間的外周胞質(zhì)，并通過一種特異性的方式不可逆地與細(xì)胞內(nèi)膜的受體/停靠蛋白（可能是定位于細(xì)胞內(nèi)膜上的一種酶型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)）結(jié)合；最終，抗菌肽進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并與其最終的靶蛋白相互作用。Apidaecin獨(dú)特的作用機(jī)制使其成為有潛力的傳統(tǒng)抗生素的替代品。

以往提取Apidaecin型抗菌肽的方法總共有兩種：一是直接從蜜蜂體內(nèi)通過化學(xué)的方法提取，這種方法將會引入很多毒性的化學(xué)試劑，并且產(chǎn)量非常的低，這種方法經(jīng)常會用在科學(xué)研究中，而不適合大規(guī)模生產(chǎn)，還有一種方法是利用已經(jīng)比較成熟的鏈霉菌、大腸桿菌和乳酸乳球菌等原核細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)去表達(dá)，但是，Apidaecin型抗菌肽對原核細(xì)胞具有殺滅的作用，這種現(xiàn)象導(dǎo)致其發(fā)酵過程很難順利完成，產(chǎn)量也比較低，所以，這種方法也很難實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了Apidaecin型抗菌肽在畢赤酵母菌中的表達(dá)方法，利用該方法可以實(shí)現(xiàn)Apidaecin型抗菌肽的規(guī)模化生產(chǎn)。

畢赤酵母是一種可高效表達(dá)外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，具有遺傳穩(wěn)定性。畢赤酵母的醇氧化酶(AOX)基因的啟動子具有強(qiáng)誘導(dǎo)性和強(qiáng)啟動性，適于外源基因的高水平誘導(dǎo)表達(dá)，可高密度發(fā)酵等許多優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用十分廣泛，已有數(shù)百種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲得表達(dá)。關(guān)于Apidaecin型抗菌肽在畢赤酵母中的表達(dá)，未見報道。

本發(fā)明提供了Apidaecin型抗菌肽在畢赤酵母菌中的表達(dá)方法，步驟如下：

（1）、Apidaecin型抗菌肽的修飾；

（2）、構(gòu)建表達(dá)載體；

（3）、酶切重組質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞；

（4）、Apidaecin型抗菌肽的表達(dá)。

進(jìn)一步地，步驟（1）中所述修飾是在5’端加入Kex2信號肽酶的切割識別位點(diǎn)，整個基因前后分別加入XhoI和Not?I位點(diǎn)。

????進(jìn)一步地，步驟（3）中所述電擊轉(zhuǎn)化的條件為：電壓為：1.5kv,電擊4ms，電擊一律在冰上進(jìn)行；電擊完畢后，放置于0℃預(yù)冷過的質(zhì)量濃度為60%的山梨醇溶液中。

進(jìn)一步地，步驟（4）中Apidaecin型抗菌肽的表達(dá)是先用BMGY培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，離心將菌體重懸后，再在搖床上繼續(xù)培養(yǎng)。

????進(jìn)一步地，所述BMGY培養(yǎng)基的配比為：質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2％的蛋白胨，1％的酵母提取物，100mmol/L的磷酸鉀緩沖液，1.34％的酵母氮堿基，0.4μg/mL的維生素H，1％的甘油，其余為ddH₂O；其中，100mmol/L磷酸鉀緩沖液在加入培養(yǎng)基前調(diào)pH至6.0；