[發(fā)明專利]二點(diǎn)委夜蛾與其形態(tài)相似種的PCR鑒定引物及其鑒定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310192234.6
• 申請日: 2013-05-22
• 公開（公告）號: CN103266174A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 褚棟;李麗莉;國棟;陶云荔
• 申請（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種二點(diǎn)委夜蛾與其形態(tài)相似種的PCR鑒定引物及其鑒定方法，特別涉及一種基于PCR-RFLP技術(shù)鑒別二點(diǎn)委夜蛾與其形態(tài)相似種的引物及鑒別方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

二點(diǎn)委夜蛾（Athetis?lepigone）屬鱗翅目，夜蛾科，委夜蛾屬。2005年首先在河北省被發(fā)現(xiàn)（姜京宇，李秀芹，許佑輝，等,2008.二點(diǎn)委夜蛾研究初報.植物保護(hù)，34（3）：23-26.）。2011年在河南、山東等6省47市302個區(qū)（縣）暴發(fā)危害，危害面積近200萬公頃，對夏玉米安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅（王振營，石潔，董金皋，2012．2011年黃淮海夏玉米區(qū)二點(diǎn)委夜蛾暴發(fā)危害的原因與防治對策．玉米科學(xué)，20（1）：132-134．）。

二點(diǎn)委夜蛾與其形態(tài)相似種在形態(tài)上相似，非專業(yè)人士不能區(qū)分，而測序方法不僅費(fèi)用高而且費(fèi)時（朱彥彬，馬繼芳，董立等，2012．基于線粒體COI基因序列的中國二點(diǎn)委夜蛾遺傳多態(tài)性分析．昆蟲學(xué)報，55（4）：457-465．），不利于二點(diǎn)委夜蛾與其形態(tài)相似種的快速鑒定。精確區(qū)分二點(diǎn)委夜蛾與其形態(tài)相似種是進(jìn)行有效防控的前提和基礎(chǔ)，這對于二點(diǎn)委夜蛾與其形態(tài)相似種的綜合防控具有重要的理論意義和指導(dǎo)價值。

PCR-RFLP（限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)，又稱為CAPS技術(shù)（Cleaved?Amplilfed?Polymorphism?Sequences），其基本原理是先利用已知位點(diǎn)的DNA序列資源（基因數(shù)據(jù)庫、基因組或cDNA克隆及克隆的RAPD條帶等）設(shè)計(jì)一套特異性的PCR引物（19～27bp），然后用這些引物擴(kuò)增該位點(diǎn)上的某一DNA片段，接著用一種專一性的限制性內(nèi)切酶切割所得擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠電泳分離酶切片段，染色并進(jìn)行RFLP分析。該技術(shù)揭示的是特異PCR片段的限制性長度變異的信息。PCR-RFLP是一類共顯性分子標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)是避免了RFLP分析中膜轉(zhuǎn)印這一步驟，又能保持RFLP分析的精確度-能夠揭示單個堿基的差異。另外，由于很多限制性內(nèi)切酶均可與DNA擴(kuò)增片段酶切，所以檢測到多態(tài)性機(jī)會較大。

PCR-RFLP技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物、動物、微生物以及昆蟲的物種檢測與鑒定、遺傳分化鑒定等方面。但利用PCR-RFLP技術(shù)構(gòu)建區(qū)分二點(diǎn)委夜蛾與其形態(tài)相似種的方法目前還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種二點(diǎn)委夜蛾與其形態(tài)相似種的PCR鑒定引物及其鑒定方法。

一種二點(diǎn)委夜蛾與其形態(tài)相似種的PCR鑒定引物，所述引物為一對，分別為SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。

正義引物F1：5’-TGAGCWGGATAGTAGGAACTTC-3’；SEQ?ID?NO.1

反義引物R1：5’-GTGACCAAAAAATCAAAATAAATG-3’；SEQ?ID?NO.2

一種二點(diǎn)委夜蛾與其形態(tài)相似種的PCR鑒定方法，步驟如下：

（1）提取待鑒定樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液；

（2）以步驟（1）制得的基因組DNA為模板，利用上述的一對引物對基因組DNA中的線粒體COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

（3）用限制性內(nèi)切酶RsaⅠ酶切步驟（2）制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得酶切產(chǎn)物；

（4）對步驟（3）制得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品在650bp無條帶時，則該被檢測樣品為二點(diǎn)委夜蛾；當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品在650bp有條帶時，則為形態(tài)相似種。

所述步驟（2）中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為：

基因組DNA溶液?2.5μl，20μM引物?0.5μl，5U/μl?Taq酶?0.25μl，10×Taq?Buffer（緩沖液）2.5μl，10mM?dNTP?0.5μl，ddH₂0補(bǔ)至25μl；

優(yōu)選的，所述步驟（2）中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下：

94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性50秒，48℃退火50秒，72℃延伸50秒，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸7分鐘。

所述步驟（3）中限制內(nèi)切酶RsaⅠ酶切反應(yīng)條件如下：37℃酶切2小時。

上述步驟（1）中提取待鑒定樣品的基因組DNA和步驟（4）中瓊脂糖凝膠電泳分析均按本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)操作。上述實(shí)驗(yàn)步驟如無特別說明均可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版（北京：科學(xué)出版社，2002）。