[發明專利]檢測microRNA-122的試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201310192187.5
• 申請日: 2013-08-27
• 公開（公告）號: CN103361420A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 夏涵;梁盼盼;黃慶;府偉靈
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 謝殿武

技術領域

本發明涉及生物領域，尤其涉及檢測microRNA-122的試劑盒及方法。

背景技術

microRNAs是在多種真核細胞及病毒中發現的一類來源內源性染色體上的非編碼單鏈小分子RNA，其長度為21～25nt，在進化上具有高度的保守性，能夠通過與其目標mRNA分子的3′端非編碼區域(3′unt?ranslated?region,3′UTR)互補導致該mRNA分子的翻譯受到抑制。miRNA參與調控真核生物超過1/3以上基因的表達、抑制靶基因的翻譯、引起mRNA的降解等，具有非常重要的生物學功能。進一步研究表明，miRNAs在細胞增殖、分化和凋亡、神經元的極性、胰島素分泌、大腦形態形成、心臟形成、胚胎發育，生物個體死亡等過程中發揮著關鍵性的作用，這些最新的研究發現為我們提供了全新的疾病發生、發展調控網絡，拓展了我們對疾病發生機制的理解和認識。

miRNAs可存在于人體的多種體液中，具有嚴格的時空性和組織特異性。循環miRNAs是正常細胞或腫瘤細胞釋放到血清/血漿的miRNAs，與目前臨床常用的蛋白質類、激素類標志物相比，可更早預測和發現疾病發生發展狀態。循壞miRNAs是基因表達水平的新型疾病相關特異性生物標志物，在臨床實驗診斷領域具有巨大的潛能和優勢，無疑將極大地提高重大疾病的診斷和治療水平。

快速、準確、靈敏的miRNAs檢測技術是確保循壞miRNAs生物標志物成功應用于臨床的關鍵環節。目前，檢測miRNAs的方法主要有Northern印跡分析、基因芯片和實時定量PCR等，但是，由于上述方法都需要預先對樣本進行反轉錄和PCR擴增，才能完成檢測，這樣既大為增加了檢測復雜性和檢測時間，又一定程度上干擾了miRNAs的定量檢測，同時預擴增存在的實驗室污染問題也極大地影響了這些檢測方法的準確性，使得這些方法的臨床實際應用受到了極大的限制。因此，針對上述問題，如能開發出一種基于新型探針技術，可避免反轉錄擴增和PCR擴增，直接對多種miRNAs進行并行定量檢測的快速、特異、簡便的miRNAs檢測方法，對于miRNAs的基礎研究和臨床實際檢測，顯然都具有十分重要的意義。

microRNA-122（miR-122）在肝臟中高度表達，在其它器官組織中的表達很低甚至檢測不到，其表達量占了肝臟中所有miRNA的70%以上，miR-122位于18號染色體上，定位于18q21.31。大量研究表明，miR-122在肝細胞生長、應激反應、脂質代謝、病毒感染、細胞增殖、基因表達、肝細胞表型維持以及肝細胞肝癌等多種生物學過程方面起調控作用，是肝臟重要的調控因子之一。目前，還沒有一種快速、特異、簡便的檢測miR-122的試劑盒及方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測miR-122的試劑盒。

一種試劑盒，包括如下結構的兩條探針，

所述非對稱發夾探針1，包括回文序列C、兩條莖臂B和b、以及連接于莖臂B上的粘性末端A，所述兩條莖臂B和b連接于回文序列C的兩端且具有互補的核酸序列，所述回文序列C為無關序列，所述莖臂B與其連接的粘性末端A具有靶序列的互補核酸序列；

所述非對稱發夾探針2，包括回文序列a、兩條莖臂B和b、和連接于莖臂B上的粘性末端c，所述兩條莖臂B和b連接于回文序列a的兩端且具有互補的核酸序列，所述回文序列a與其相連的一條莖臂b具有靶序列，粘性末端c具有和非對稱發夾探針1中所述的無關序列C互補的核酸序列；

所述microRNA-122的靶序列為：

ACUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG。

優選：所述非對稱發夾探針1的核苷酸序列為：CAAACA?CCATTGTCACACTCCAGT?CAAAGT?ACTGGAGTGTGACAATGG

所述非對稱發夾探針2的核苷酸序列為：ACTGGAGTGTGACAATGG?TGTTTG?CCATTGTCACACTCCAGT?ACTTTG。

一種雜交鏈反應體系，包括上述非對稱發夾探針1和非對稱發夾探針2。

所述反應體系還包括待測microRNA-122的靶序列。

本發明還提供一種檢測microRNA-122方法。

一種檢測microRNA-122方法，包括以下步驟：

（1）將上述非對稱發夾探針1和非對稱發夾探針2以及待測microRNA-122加入到雜交鏈反應體系中進行反應，得到反應產物；

（2）對所述步驟（1）得到的反應產物進行電泳檢測；

其反應時的條件為99℃，8分鐘；50℃，1小時。