[發明專利]一種臨床級神經干細胞系的建立方法及用途

無效

• 申請號: 201310192179.0
• 申請日: 2013-05-22
• 公開（公告）號: CN103451153A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 欒佐
• 申請（專利權）人: 欒佐
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;A61K35/30;A61P25/00;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于細胞生物學、神經生物學領域，特別是涉及一種神經干細胞系的建立方法及用途。

背景技術

中樞神經系統損傷曾被認為不可修復，傳統的藥物等治療方法也以維持現有神經細胞存活和功能為主。近年來，隨著干細胞技術的研究和發展，研究人員發現神經系統損傷疾病發生時損傷丟失的神經細胞可以通過移植干細胞來恢復，且這種方法十分有效。神經干細胞(neural?stem?cells，NSCs)是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞，由于NSCs來源于神經系統，是天生的成神經細胞，神經干細胞移植治療神經系統損傷疾病是最理想的選擇。NSCs在體內外均能分化為各種神經細胞，移植到裸鼠體內不致瘤。臨床上已有將神經干細胞應用于多種人神經系統損傷疾病治療并取得很好療效的報道。

但是，由于NSCs常來源于引產的胚胎組織，通常的體外培養方法僅能對NSCs進行短期培養，一個胚胎組織最終能獲得的細胞數量有限，如果要進行大規模的臨床治療研究，通常需要獲得多個胚胎組織樣本，如此存在較大的倫理學爭議風險，同時不同樣本來源的細胞其生物學性狀存在差異，由此導致的結果也存在一定的變異性，因而影響了科學數據的準確性。因此，如果可以建立臨床級NSCs細胞系，理論上可從一個胚胎樣本中獲得無限的可供臨床治療研究的NSCs，且這些NSCs生物學性狀維持不變，可以有效避免采用非建系神經干細胞進行臨床治療研究產生的問題。

另外，由于神經干細胞的單克隆形成能力低下，通常方法很難由一個神經干細胞培養成為神經干細胞球，而多個神經干細胞培養后形成的細胞球由于來源于多個細胞，細胞起始的不均一性更大，如此為之后的基礎或臨床研究增加難度。

建立穩定的神經干細胞建系有助于我們進一步進行NSCs移植治療神經系統疾病的相關研究，但目前報道的神經干細胞建系的建立均基于轉基因技術，即將永生化相關的基因如端粒酶基因或原癌基因穩定轉染NSCs從而獲得可以長期培養的NSCs，轉基因技術可能會改變NSCs的部分生物學性狀，甚至產生致瘤性，給研究帶來風險與變數。因此，建立非轉基因的NSCs細胞系有助于獲得NSCs治療神經系統疾病的準確研究結果。

發明內容

鑒于以上缺陷，本發明的主要目的在于提供一種臨床級神經干細胞系的建立方法及用途。

為了達到以上目的，本發明提供的該種臨床級神經干細胞系的建立方法，在GMP控制下，包括神經干細胞原代培養和神經干細胞傳代培養兩個步驟，其中，所述神經干細胞傳代培養具體再包括以下步驟：

1).半量換液及收集神經干細胞條件培養基：當神經干細胞原代培養的半數神經球直徑超過150μm時，豎立細胞培養瓶2分鐘，使神經干細胞球沉降至瓶底，離心管吸出半量培養基之后，加入等量的新鮮神經干細胞原代培養基，換液完畢后放回細胞培養箱繼續培養，再將上述吸出的半量培養基收集到15ml的離心管中，1300轉/分鐘離心5分鐘，收集上清即可獲得神經干細胞條件培養基，保存4℃備用；

2).預處理：在神經干細胞傳代前一天，向新的細胞培養瓶中加入適量神經干細胞條件培養基，備用；

3).當培養神經干細胞的半數神經球直徑超過200μm時，將神經干細胞及培養基收集到50ml離心管中，1300轉/分鐘離心5分鐘，收集上清即可獲得神經干細胞條件培養基，保存4℃備用；再將神經干細胞球重懸于神經干細胞消化液中，置于37℃培養箱消化10分鐘，待可見細胞球略微松散時，加入胰酶抑制劑終止消化，采用巴斯德吸管將細胞輕輕吹打分散；

4).離心收集細胞，離心條件為1300轉/分鐘，5分鐘；

5).取出前一天采用神經干細胞條件培養基預處理的細胞培養瓶，吸棄其中的培養基；

6).將神經干細胞傳代培養基與神經干細胞條件培養基1∶1混合，之后采用此混合培養基重懸消化后的神經干細胞，并按1∶3傳代接種于預處理過的細胞培養瓶；

7).將傳代后的神經干細胞置于細胞培養箱中培養；

8).換液：傳代3～5天后，進行半量換液：豎立細胞培養瓶2分鐘，使神經干細胞球沉降至瓶底，離心管吸出半量培養基之后，加入等量的新鮮神經干細胞傳代培養基，換液完畢后放回細胞培養箱繼續培養，再將上述吸出的半量培養基收集到15ml的離心管中，1300轉/分鐘離心5分鐘，收集上清即可獲得神經干細胞條件培養基，保存4℃備用；

9).重復按步驟2)-8)方法進行神經干細胞的傳代并培養，建立穩定的神經干細胞系。

更進一步的，所述神經干細胞原代培養可以通過步驟實現：