[發明專利]一種臨床級神經干細胞系的建立方法及用途

無效

• 申請號: 201310192179.0
• 申請日: 2013-05-22
• 公開（公告）號: CN103451153A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 欒佐
• 申請（專利權）人: 欒佐
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;A61K35/30;A61P25/00;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種臨床級神經干細胞系的建立方法，在GMP控制下，包括神經干細胞原代培養和神經干細胞傳代培養兩個步驟，其特征在于，所述神經干細胞傳代培養具體再包括以下步驟：

1).半量換液及收集神經干細胞條件培養基：當神經干細胞原代培養的半數神經球直徑超過150μm時，豎立細胞培養瓶2分鐘，使神經干細胞球沉降至瓶底，離心管吸出半量培養基之后，加入等量的新鮮神經干細胞原代培養基，換液完畢后放回細胞培養箱繼續培養，再將上述吸出的半量培養基收集到15ml的離心管中，1300轉/分鐘離心5分鐘，收集上清即可獲得神經干細胞條件培養基，保存4℃備用；

2).預處理：在神經干細胞傳代前一天，向新的細胞培養瓶中加入適量神經干細胞條件培養基，備用；

3).當培養神經干細胞的半數神經球直徑超過200μm時，將神經干細胞及培養基收集到50ml離心管中，1300轉/分鐘離心5分鐘，收集上清即可獲得神經干細胞條件培養基，保存4℃備用；再將神經干細胞球重懸于神經干細胞消化液中，置于37℃培養箱消化10分鐘，待可見細胞球略微松散時，加入胰酶抑制劑終止消化，采用巴斯德吸管將細胞輕輕吹打分散；

4).離心收集細胞，離心條件為1300轉/分鐘，5分鐘；

5).取出前一天采用神經干細胞條件培養基預處理的細胞培養瓶，吸棄其中的培養基；

6).將神經干細胞傳代培養基與神經干細胞條件培養基1∶1混合，之后采用此混合培養基重懸消化后的神經干細胞，并按1∶3傳代接種于預處理過的細胞培養瓶；

7).將傳代后的神經干細胞置于細胞培養箱中培養；

8).換液：傳代3～5天后，進行半量換液：豎立細胞培養瓶2分鐘，使神經干細胞球沉降至瓶底，離心管吸出半量培養基之后，加入等量的新鮮神經干細胞傳代培養基，換液完畢后放回細胞培養箱繼續培養，再將上述吸出的半量培養基收集到15ml的離心管中，1300轉/分鐘離心5分鐘，收集上清即可獲得神經干細胞條件培養基，保存4℃備用；

9).重復按步驟2)-8)方法進行神經干細胞的傳代并培養，建立穩定的神經干細胞系。

2.根據權利要求1所述的一種臨床級神經干細胞系的建立方法，其特征在于，所述神經干細胞原代培養具體包括以下步驟：

a.在完全知情同意告知下，無菌條件下分離10-16周無發育障礙流產胎兒的海馬、皮層或紋狀體組織，置于無菌的離心管中，剪刀剪碎；

b.加入神經干細胞消化液，消化10分鐘，將細胞消化為單細胞懸液；

c.將細胞懸液按1300轉/分鐘的離心速度離心5分鐘以收集細胞，將細胞重懸于神經干細胞原代培養基中，使其密度為4～5×105/ml；

d.將細胞懸液接種于T25細胞培養瓶中，置于細胞培養箱培養。

3.根據權利要求1所述的一種臨床級神經干細胞系的建立方法，其特征在于，所述神經干細胞原代培養具體包括以下步驟：

a).在完全知情同意告知下，無菌條件下分離10-16周無發育障礙流產胎兒的海馬、皮層或紋狀體組織，置于無菌的離心管中，剪刀剪碎；

b).加入神經干細胞消化液，消化10分鐘，將細胞消化為單細胞懸液；

c).采用流式細胞分離或者棋盤滴定的方法，將單細胞懸液接種到96孔板，使得每個孔只含有1個細胞，采用神經干細胞原代培養基進行培養。

4.根據權利要求1-3任意一項所述的一種臨床級神經干細胞系的建立方法，其特征在于，所述神經干細胞原代培養基由基礎培養基、B27、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、白血病抑制因子、轉鐵蛋白、孕酮、腐胺、硒酸鈉、胰島素、肝素組成，其中，所述B27為1×；表皮生長因子濃度15-25ng/ml，堿性成纖維細胞生長因子濃度15-25ng/ml，白血病抑制因子濃度7-13ng/ml，轉鐵蛋白濃度50-150μg/ml，孕酮10-30nmol/L，腐胺50-150μmol/L，硒酸鈉20-40nmol/L，胰島素10-49μg/ml，肝素3-10μg/ml，所述基礎培養基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖組成，其中，DMEM和F12比例為體積比(1-3)∶1，HEPES濃度為10-20mmol/L，D-葡萄糖濃度為質量/體積比1-2g/100ml。