[發明專利]一種高效的木豆毛狀根培養體系建立方法

無效

• 申請號: 201310190956.8
• 申請日: 2013-05-22
• 公開（公告）號: CN104017822A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 王慧梅;付玉杰;王文杰;祖元剛;曲丹;任潔
• 申請（專利權）人: 東北林業大學;王慧梅
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明是一種高效的木豆毛狀根培養體系建立方法，遺傳轉化率高且周期短，毛狀根生長速度快，次生代謝產物含量高。本發明屬于農業生物技術領域。

背景技術：

木豆[Cajanus?cajan（L.）Millspaugh]，蝶形花科（Papilionaceae），木豆屬（Cajanus），是一種短期夏季生長的一年生豆類作物，因豆莢結于樹冠枝梢上，故稱木豆；鴿子愛吃，又稱鴿豆；是世界第六大食用豆類，也是木豆屬中唯一的一個栽培種。木豆的根、莖、葉、花、莢和種子都可以入藥，全身是寶，除具有很高的經濟、生態利用價值外，還具有顯著的藥用價值。

在木豆根的有效藥用化學成分中，芹菜素和染料木素是主要的黃酮苷元成分，具有很好的藥理活性。芹菜素具有抑制致癌物質活性，作為治療HIV和其它病毒感染的抗病毒藥物，具有低毒、無誘變性的特點。染料木素具有抗氧化作用，可以抑制酪氨基酸蛋白激酶（PTK）和拓撲異構酶Ⅱ的活性，具有誘發細胞程序性死亡、提高抗癌藥效、抑制血管生成等作用，是一種很有潛力的癌癥化學預防劑，其抗癌作用及機制具有廣泛的應用前景。

利用毛狀根培養技術生產有價值的木豆次生代謝產物芹菜素和染料木素是一條經濟有效的途徑，毛狀根具有生長迅速、生長和遺傳穩定以及在無激素的培養基上生長等特點，它能夠合成與原植物含量相當或高于原植物含量的次生代謝產物，而且生產能力穩定，利于天然產物的開發和利用。因此利用發根農桿菌侵染木豆葉片，產生毛狀根，并對毛狀根進行繼代增殖培養，可規模化生產芹菜素和染料木素，是木豆藥用資源可持續發展的有效途徑之一。

發明內容：

本發明的目的是提供一種遺傳轉化率高，毛狀根生長速度快且次生代謝產物含量高的木豆毛狀根遺傳轉化體系建立方法，為木豆有藥用價值次生代謝產物生產源源不斷地提供原料。該發明為利用毛狀根培養規模化生產木豆有價值的次生代謝產物成分奠定基礎。

本發明主要是涉及利用木豆無菌苗的葉片為外植體，利用發根農桿菌介導，建立木豆毛狀根培養體系的方法。主要包括外源生長調節物質，培養基組成，預培養時間，共培養時間，菌液濃度，侵染時間等，建立快速高效的木豆毛狀根培養體系。

具體的技術路線包括以下幾方面內容：

1、木豆無菌苗的獲得：

將滅菌后的木豆種子接種到MS+20g/L蔗糖+8g/L瓊脂的培養基上培養，一個星期左右，木豆種子發芽，兩周左右可獲得木豆的無菌苗。

2、外植體轉化

在超凈工作臺中，將木豆植株葉片剪成兩端有傷口，約0.5cm×0.5cm大小，放在1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂8.0g/L的培養基上，26℃暗培養，預培養2天后，將木豆葉片放進發根農桿菌LBA9402菌液（OD₆₀₀為0.6-0.8）中浸染20min，用無菌濾紙吸去多余菌液，放在共培養培養基1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂8.0g/L上共培養3天。

3、外植體抑菌

共培養3天后，將木豆葉片轉入含有400mg/L羧芐青霉素的1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂8.0g/L培養基上抑菌，20天后將感染后長出的毛狀根，從葉片上剪下，放到含有400mg/L羧芐青霉素的1/2MS培養基上培養，并觀察毛狀根的除菌情況，調整培養基中羧芐青霉素含量，直至毛狀根除菌完全。

4、轉化毛狀根PCR檢測

完全抑菌的毛狀根經PCR檢測表明，外源基因已經整合到毛狀根體內，具有很高遺傳轉化率，遺傳轉化率為60%。

5、木豆毛狀根次生代謝產物含量檢測

采用HPLC法，對木豆毛狀根次生代謝產物含量進行檢測，木豆毛狀根的芹菜素和染料木素的含量分別為0.58mg/g(DW)和1.32mg/g(DW)，顯著高于木豆實生苗中芹菜素和染料木素的含量，高出2倍之多。

6、木豆毛狀根繼代增殖培養

將上述獲得的毛狀根接種到無激素培養基1/2MS+蔗糖20g/L中進行繼代增殖培養，毛狀根生長速度快，保持很高的增殖倍數，一個月能增殖7-8倍。

本發明所使用的培養基都是按照常規的方法處理的，pH值均為5.8-6.0，高溫高壓（121℃，1.5個大氣壓）20min后使用的。

本發明的培養室是在常規的組織培養室（溫度25℃左右，光照1000-1500lux，光/暗周期16h/8h，濕度70%左右）中進行的。

本發明的技術特征:.

1）以木豆無菌苗葉片為外植體建立了木豆毛狀根培養體系。