[發(fā)明專利]一種高效的木豆毛狀根培養(yǎng)體系建立方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310190956.8
• 申請日: 2013-05-22
• 公開（公告）號: CN104017822A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王慧梅;付玉杰;王文杰;祖元剛;曲丹;任潔
• 申請（專利權(quán)）人: 東北林業(yè)大學(xué);王慧梅
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種高效的木豆毛狀根培養(yǎng)體系建立方法，其特征在于：

1）采用木豆無菌苗葉片為外植體進行轉(zhuǎn)化；2)確立了適合木豆遺傳轉(zhuǎn)化的預(yù)培養(yǎng)時間、菌液濃度、侵染時間及共培養(yǎng)時間；3）外植體抑菌培養(yǎng)抑菌劑選擇；4）確立了最佳的預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)及繼代增殖培養(yǎng)基；5）此轉(zhuǎn)化程序具有很高的遺傳轉(zhuǎn)化率，毛狀根生長速度快，次生代謝產(chǎn)物含量高。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效的木豆毛狀根培養(yǎng)體系建立方法，其主要特征在于：采用木豆無菌苗的葉片為外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化，操作方便，可以避免外植體滅菌不徹底帶來的污染，外植體易于獲得，一個星期左右，便可以從葉片邊緣誘導(dǎo)出毛狀根，再生速度快。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效的木豆毛狀根培養(yǎng)體系建立方法，其主要特征在于：用于轉(zhuǎn)化的葉片外植體預(yù)培養(yǎng)時間為2天，時間超過兩天，轉(zhuǎn)化假陽性比較多；侵染時菌液濃度OD₆₀₀的值為0.6-0.8，菌液濃度低于0.6，木豆毛狀根再生速度慢，遺傳轉(zhuǎn)化率低，菌液濃度大于0.8，外植體抑菌困難，外植體易褐化死亡，降低遺傳轉(zhuǎn)化率；最佳侵染時間為20min，侵染時間過短或過長，均不利于外植體遺傳轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化外植體共培養(yǎng)時間為3天，共培養(yǎng)時間過長，發(fā)根農(nóng)桿菌過度增殖，抑菌困難。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效的木豆毛狀根培養(yǎng)體系建立方法，其主要特征在于：共培養(yǎng)后，外植體轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基，所采用的抑菌劑為羧芐青霉素，羧芐青霉素不但抑菌效果好，而且毛狀根的生長速度未受影響。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效的木豆毛狀根培養(yǎng)體系建立方法，外植體預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂8.0g/L培養(yǎng)基，繼代增殖的基本培養(yǎng)基為MS+蔗糖20g/L。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效的木豆毛狀根培養(yǎng)體系建立方法，其主要特征在于：遺傳轉(zhuǎn)化率高，PCR檢測證明，發(fā)根農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒所攜帶的目的基因已經(jīng)整合進木豆毛狀根體內(nèi)，遺傳轉(zhuǎn)化率為60%，毛狀根生長速度快且次生代謝產(chǎn)物含量高，一個月能增殖7-8倍，芹菜素和染料木素的含量分別為0.58mg/g(DW)和1.32mg/g(DW)。