[發明專利]一種顱神經嵴源性干細胞的培養方法和鑒定方法

有效

• 申請號: 201310189912.3
• 申請日: 2013-05-21
• 公開（公告）號: CN103305465A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 聶鑫;溫秀杰;行勇軍;劉魯川;鄧蔓菁;劉銳
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;C12Q1/34;C12Q1/04
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

技術領域

本發明屬于干細胞生物技術領域，涉及顱神經嵴源性干細胞的培養、純化與鑒定。

背景技術

神經嵴源性干細胞是胚胎發育過程中的一種重要細胞類型，起源于胚胎發育早期的顱神經嵴在胚胎早期神經管閉合之前，顱神經嵴干細胞發生廣泛遷移，其定位于上、下頜突內的神經嵴源性干細胞又稱為外胚間充質干細胞外胚間充質干細胞屬于胚胎發育時期過渡細胞，在牙發育中進一步分化形成牙周膜干細胞、牙髓干細胞，這些干細胞一并也稱為神經嵴源性干細胞。

神經嵴細胞的遷移可以根據嵴細胞的顯著形態學特征進行觀察;在明顯表達表型之前，神經嵴細胞就廣泛地遷移并精確定位于在胚胎各處，可分為顱神經嵴細胞和軀干神經嵴細胞。嵴細胞的多向分化潛能以及胚胎環境對嵴細胞遷移、定位和表型表達影響的研究證實，顱神經嵴細胞參與了頜面部各組織器官的發育。在神經褶形成時或神經管形成之后，顱神經嵴細胞向側腹方遷移到第一和第二咽囊之間的細胞，形成舌弓;眼前方的顱神經嵴細胞參與顱骨的形成;上、下頜突組織內的顱神經嵴細胞參與了牙齒的發育。

近印來，顱神經嵴干細胞因其具有自我復制和多向分化潛能、參與多種組織修復再生等優點，并在頜面部組織器官發育中起著重要作用，而受到研究者的普遍關注。迄今為止，國內外研究者一直通過不同途徑了解神經嵴源性干細胞的生物學特性。由于神經嵴組織量小，采用常規顯微手術方式分離神經嵴組織獲取該類細胞，還存在相當的技術操作難度和進一步純化問題。目前，神經嵴源干細胞的特異性表面分子仍在探尋中，這也給神經嵴源性細胞的分離、純化的實際應用帶來了一定的困難。專利公開號為CN101717750A及CN101717751A采用間葉系干細胞特異性標志物stro-1和CD146作為牙周膜干細胞及牙髓干細胞的標記物僅能證實其間充質源性，對于神經嵴源性卻無法證實。專利公開號為CN1590537采用特異性抗體HNK-1/CD57獲得的細胞需要用牛垂體提取物及白細胞抑制因子維持外胚間充質干細胞的增殖及生物學穩定性，細胞獲取操作復雜，在體外培養容易分化，且HNK-1/CD57主要集中表達于牙源性外胚間充質細胞，其它頜突組織并無特異性。

發明內容

本發明的目的是提供一種顱神經嵴源性干細胞的培養方法。

本發明的目的是通過以下措施實現的:

一種顱神經嵴源性干細胞的培養方法，其特征在于:采用sox-2基因從11～12天鼠胚頜突組織中分選所述顱神經嵴源性干細胞。優選為11.5天的鼠胚頜突組織。該時期顱神經嵴干細胞游走至頜突組織，形成特定的細胞凝聚區。該時間節點的細胞仍保持顱神經嵴源性多能干細胞特性，尚未受局部微環境誘導，參與頜面組織器官發育及成牙分化的基因尚未啟動，有利于通過體外培養研究神經嵴細胞基本特。

在顱神經嵴發育期，sox-2沿神經外胚層表達，呈帶狀分布。在胚胎發生中，sox-2基因表現出多樣、動態的表達模式，在各種發育事件中起著重要作用。sox-2在顱面部組織中提取的神經嵴源性干細胞均為強表達，而在軀干神經嵴中不表達或呈弱表達。sox-2主要表達于早期鼠胚的多能性干細胞，成熟細胞無表達，sox-2與終末分化細胞的標記基因以相互排斥的方式表達，有利于神經嵴源性干細胞的篩選與純化。

上述采用sox-2基因分選是指采用帶熒光sox-2+抗體標記細胞，在流式細胞儀上分選，獲取sox-2+細胞。可以去除原代細胞中非神經嵴源性雜細胞，使細胞得到高度純化。

上述原代細胞的培養基為DMEM/F12培養基，添加以下成分:10%胎牛血清(FBS)，5g/L碳酸氫鈉，0.15g/LL-谷氨酰胺，100IU/L青霉素。在該條件下維持穩定的細胞表型細胞并保持較快的增殖活性具有顯著優勢。

上述原代細胞獲取與培養，包括以下步驟:消化所述鼠胚頜突組織，使組織分散成細胞懸液，細胞篩過濾得到原代細胞并培養，其特征在于:所述細胞篩的孔徑為75μm濾網。該濾網作為細胞篩，可去除組織碎片及未能成功消化的細胞團塊。

上述顱神經嵴源性干細胞的培養方法，還包括以下步驟:將上述細胞懸液離心后，棄上清，加入上述培養基，使細胞重懸后通入細胞篩，其特征在于:離心的轉速為800～1000rpm，離心時間為3～5分鐘。可有效地進行細胞沉淀，去除消化酶，并保證細胞活性。

上述顱神經嵴源性干細胞的培養方法:所述原代細胞的培養條件為將所述原代細胞置入5%CO2培養箱，在37℃恒溫下培養，培養至第2天換液，此后每1-3天進行一次全換液。該條件為體外模擬細胞生長的體內環境，保持細胞的生物學特性。