[發明專利]一種顱神經嵴源性干細胞的培養方法和鑒定方法

有效

• 申請號: 201310189912.3
• 申請日: 2013-05-21
• 公開（公告）號: CN103305465A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 聶鑫;溫秀杰;行勇軍;劉魯川;鄧蔓菁;劉銳
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;C12Q1/34;C12Q1/04
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

1.一種顱神經嵴源性干細胞的培養方法，其特征在于：采用sox-2基因從11～12天鼠胚頜突組織中分選所述顱神經嵴源性干細胞。

2.如權利要求1所述的顱神經嵴源性干細胞的培養方法，其特征在于：采用sox-2基因從11.5天鼠胚頜突組織中分選所述顱神經嵴源性干細胞。

3.如權利要求1或2所述的顱神經嵴源性干細胞的培養方法，所述采用sox-2基因是指采用帶熒光sox-2+抗體標記細胞，在流式細胞儀上分選得到sox-2陽性細胞。

4.如權利要求1、2或3所述的顱神經嵴源性干細胞的培養方法，包括原代細胞獲取與培養，sox-2+細胞的分選，其特征在于所述原代細胞的培養基為DMEM/F12培養基、10%胎牛血清（FBS）、5g/L碳酸氫鈉、0.15g/L?L-谷氨酰胺、100?IU/L青霉素。

5.如權利要求4所述的顱神經嵴源性干細胞的培養方法，所述原代細胞獲取與培養，包括以下步驟：消化所述鼠胚頜突組織，使組織分散成細胞懸液，細胞篩過濾得到原代細胞并培養，其特征在于：所述細胞篩的孔徑為75μm濾網。

6.如權利要求4或5所述的顱神經嵴源性干細胞的培養方法，所述原代細胞的培養條件為將所述原代細胞置入5%CO2培養箱，在37℃恒溫下培養，培養至第2天換液，此后每1-3天進行一次全換液。

7.如權利要求4、5或6所述的顱神經嵴源性干細胞的培養方法，還包括將細胞懸液離心后，重懸，再過細胞篩，所述離心的轉速為800～1000rpm，離心時間為3～5分鐘。

8.如權利要求1所述的顱神經嵴源性干細胞的培養方法，包括以下步驟：?

(1)原代細胞獲取與培養：在無菌條件下，切取妊娠11～12天鼠胚的頜突組織，剪碎后用0.25%胰酶/0.1mM的EDTA，消化5～10分鐘，DMEM/F12培養基終止消化后吹打使組織分散成細胞懸液，800～1000rpm離心3～5分鐘，棄上清；加入含10%FBS的DMEM/F12培養基使細胞重懸后通過75μm細胞篩，將過濾后細胞懸液分裝入培養瓶中；沿培養皿邊緣加入10%FBS的DMEM/F12培養基，置入5%CO2培養箱，在37℃恒溫下培養，培養至第2天換液，此后每1-3天進行一次全換液;

(2)sox-2+細胞的分選：細胞鋪滿瓶底時，0.25%胰酶/0.1?mM的EDTA消化30秒，10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化，吹打使細胞分散懸浮，800～1000rpm離心3～5分鐘，棄上清；加入0.01?M的PBS洗滌，800～1000rpm離心3～5分鐘；加入1：50的帶熒光sox-2+抗體標記和PBS共500mm，在5%CO2?、37℃培養箱乳化1?h；PBS洗滌，在流式細胞細胞儀上進行分選，將獲取sox?-2+細胞繼續培養傳代。

9.一種顱神經嵴源性干細胞的鑒定方法，采用p75NTR鑒定細胞的神經嵴源性，采用CD29,?CD44,?CD90,?CD105,?Stro-1鑒定細胞的干細胞特性，誘導脂肪、誘導成骨、誘導成軟骨和誘導神經分化鑒定細胞多向分化特性。

10.如權利要求9所述的顱神經嵴源性干細胞的鑒定方法，包括以下步驟：

(1).待鑒定細胞鋪滿瓶底時，采用0.25%胰酶/0.1?mM的EDTA?消化30秒，10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化，吹打使細胞分散懸浮，800～1000rpm離心3～5分鐘，棄上清；加入PBS洗滌，再次離心，棄上清，4%多聚甲醛固定20分鐘，加入PBS洗滌，離心，棄上清；1%?BSA-PBS封閉30分鐘，PBS洗滌，離心，棄上清；采用帶熒光p75^NTR抗體（1﹕100）標記細胞，過夜，在流式細胞儀上根據不同象限計算細胞陽性率；

(2).步驟（1）得到的p75^NTR陽性顱神經嵴源性干細胞，鋪滿瓶底時，采用0.25%胰酶/0.1?mM的EDTA?消化30秒，10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化，吹打使細胞分散懸浮，800～1000rpm離心3～5分鐘，棄上清；加入PBS洗滌，再次離心，棄上清，4%多聚甲醛固定20分鐘，加入PBS洗滌，離心，棄上清；1%?BSA-PBS封閉30分鐘，PBS洗滌，離心，棄上清；加入CD29,?CD44,?CD90,?CD105,?Stro-1,?p75一抗（1：100）過夜，加入PBS洗滌，再次離心，棄上清；加入熒光2抗（1：800）乳化1小時，流式細胞儀檢測陽性率；

(3).步驟（2）得到的陽性顱神經嵴源性干細胞以1×10⁵接種至6孔板內，分別加入脂肪誘導培養液、成骨誘導培養液、成軟骨誘導培養液和神經分化誘導液，觀察干細胞的多系譜分化特性。