[發明專利]具有吸附重金屬離子功能的融合蛋白的構建、表達及其在生物除污中的應用

有效

• 申請號: 201310188599.1
• 申請日: 2013-05-20
• 公開（公告）號: CN103288967A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 王宏;劉斌;楊海濤;伍建軍;張紹偉;高社
• 申請（專利權）人: 廣州柏縱生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/74;C12N1/21;A61K8/64;A61K8/99;A61K35/74;A61K38/16;A61K47/48;A61P39/02;C12R1/25;C12R1/245;C12R1/01
• 代理公司: 北京市漢信律師事務所 11373
• 代理人: 王文生

技術領域

本發明涉及一種包含金屬結合多肽和連接肽的十聚體與皮膚細胞黏附三肽的融合蛋白，還涉及一種細胞表面展示表達所述融合蛋白的乳酸菌。具體地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No：4所示。本發明還涉及所述融合蛋白或細胞表面展示表達所述融合蛋白的乳酸菌在制備用于結合皮膚表面有毒重金屬的化妝品或藥物中的應用。另外，本發明還涉及一種去除皮膚表面有毒重金屬的藥物或化妝品，所述藥物或化妝品包含所述融合蛋白或細胞表面展示表達所述融合蛋白的乳酸菌。

背景技術

隨著中國各產業工業化的發展，重金屬污染已成為社會十分關注的問題。大量的有毒重金屬離子通過水、空氣、土壤以及生物鏈污染到人類賴于生存的動植物產品及水源上，給人們的健康帶來潛在的危害。一般來說，重金屬污染是指鉛、汞、鎘、砷等重金屬離子的污染。其主要來源一方面是未經處理的工業廢水、廢氣、廢渣的隨意排放。另一方面則是農業上濫用的農藥和化肥。

有毒重金屬可以通過水、空氣及日常生活用品(眼鏡、化妝品、服裝、玩具等)對人體皮膚的健康帶來諸如角質化、色斑、粗糙、提前衰老等極大危害。由于生活中重金屬污染常以慢性中毒的方式影響人類，因此，這種危害又往往容易被人們所忽視。

在動物、高等植物、真核微生物和一些原核生物中存在一些富含半胱氨酸的重金屬結合蛋白(如金屬硫蛋白、植物螯合素等)。這些重金屬結合蛋白可以利用其半胱氨酸殘基上的巰基與重金屬結合，形成無毒或低毒的絡合物。生物體在遇到重金屬污染的環境時會持續大量表達結合蛋白，進而減少或清除重金屬對機體的毒害。進一步研究顯示，部分含組氨酸的多肽也具有結合重金屬離子的功能。Sousa等在大腸桿菌中表達6個組氨酸(His-His-His-His-His-His)的多肽，結果發現，該重組菌吸附鎘的含量比對照組的高6-11倍(Sousa?et?al.，Nature?Biotechnololgy，1996，14(8)：1017-1720)。更有趣的是，部分研究顯示，含組氨酸殘基的金屬結合多肽在以串聯方式進行重復表達時，其結合重金屬能力有增加的趨勢(Mejáre?and?Bülow，TRENDS?in?Biotechnology，2001，19(2)：67-73)。Kotrba等在大腸桿菌中表達另一個含組氨酸多肽(Gly-His-His-Phe-His-Gly)的二聚體，結果發現，重組菌表面結合鎘的含量大概比對照組的高3倍(Kotrba?et?al.，Applied?and?Environmental?Microbiology，1999，65：1092-1098)。

富含半胱氨酸的金屬硫蛋白在重金屬解毒方面起著重要的作用，然而，利用基因工程的方法很難在宿主中進行大量重組表達。一方面，金屬硫蛋白分子量小，半胱氨酸殘基多，難以可溶性表達；另一方面，大量巰基也會阻礙宿主細胞正常的氧化還原途徑，嚴重影響宿主細胞正常生理活動。因此，在宿主細胞表面進行展示表達含組氨酸的金屬結合多肽是解決這方面困難的一個有效方法。

乳酸菌是一類能大量發酵碳水化合物并產生乳酸的革蘭氏陽性細菌，其包括乳酸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌等十幾個屬，在食品工業各個領域中的長期應用已證明其無致病性，被公認為安全級微生物。在人和大多數動物體內及各種人類生活環境中廣泛分布。研究發現，乳酸菌具有提供人體必需的營養物質、維持泌尿生殖系統健康、增強機體免疫作用、降低膽固醇含量、改善胃腸道功能以及抗腫瘤作用等多種重要的生理功能。有鑒于其具有極其重要應用價值，從20世紀80年代開始，人們就開始致力于對各種乳酸菌，尤其是乳酸乳桿菌，的生物學特性和分子機制研究。乳桿菌作為表達外源蛋白的理想菌株有其獨特的優勢：首先，該菌已經進行全基因組測序，其所有的功能基因以及生化途徑一清二楚；其次，乳桿菌抗原性弱，不會產生內毒素，宿主本身不會引起強烈的免疫應答；最后，乳桿菌現時已作為一種食品級表達宿主用于表達各種抗原、生長因子以及功能蛋白。

本發明的主要目的就是將包含金屬結合多肽十聚體和皮膚細胞黏附三肽的融合蛋白在乳酸菌表面進行展示表達，皮膚細胞黏附三肽有助于將融合蛋白黏貼在皮膚表面(趙強，等，2003，生物醫學工程學雜志，20(3)：384-387)，而金屬結合多肽十聚體則能結合皮膚表面的有毒重金屬離子，形成無毒的復合物。最后，將結合有毒重金屬離子的工程菌從人體皮膚上洗脫，可有效從而減少有毒重金屬在皮膚中的積聚及損害，實現生物除污的效果。

發明內容