[發明專利]可溶性HIV-1整合酶重組蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 201310188288.5
• 申請日: 2013-05-20
• 公開（公告）號: CN103275945A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 李春華;李杉;劉斌;何紅秋;段彥華;張小軼;譚建軍;王存新
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/70
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說是涉及一種可溶性HIV-1整合酶重組蛋白的制備方法。

背景技術

HIV-1整合酶由HIV-1?pol基因編碼，包含288個氨基酸殘基，分子量約為32?kDa。整合酶催化經逆轉錄形成的HIV-1?cDNA整合到宿主細胞的基因組中，是HIV-1復制周期中的必需環節。由于人體細胞中沒有整合酶的功能類似物，作用于整合酶的抑制劑對人體的潛在副作用很小，故整合酶被認為是抗HIV-1藥物研究的理想靶點。

在HIV-1整合酶相關的機理及藥物研究中，通常需要用原核表達純化的手段制備整合酶重組蛋白。然而，用現有的原核表達純化手段制備整合酶重組蛋白時，普遍存在目的蛋白可溶性差、易形成包涵體、產率低的問題，對后續研究造成一定程度的影響。

發明內容

本發明的目的是提供一種步驟簡單、快速便捷且成本低廉的HIV-1整合酶鏈轉移反應抑制劑體外篩選方法。

本發明所提供的一種可溶性HIV-1整合酶重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：

（1）?將以pET-28a（+）載體為基礎構建的整合酶重組蛋白表達載體轉化入大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，挑取陽性克隆接種于5?ml含有50?mg/L卡那霉素的LB液體培養基，37?℃搖床振蕩培養12-16?h得到培養物；

（2）?將（1）中的培養物按體積比1?%接種于表達培養基中，37?℃搖床振蕩培養至菌液OD600值達到0.8，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的終濃度為0.4?mM，37?℃搖床振蕩培養4-5?h得到培養物；所述表達培養基含有15-35?g/L胰蛋白胨，10-20?g/L酵母提取物，2-3?g/L氯化鈉，1?g/L葡萄糖，10-15?g/L甘油，2.05?g/L磷酸氫二鈉，1.27?g/L磷酸二氫鈉，50?mg/L硫酸鎂，60?mg/L卡那霉素；

（3）?將（2）中的培養物離心得到沉淀，每100?mg沉淀用1?ml裂解緩沖液重懸，室溫孵育30?min，反復凍融兩次之后置于冰浴中超聲破碎10?min，4?℃離心收集上清液；所述裂解緩沖液含有20?mM?4-羥乙基哌嗪乙磺酸，1?M氯化鈉，2?mM?β-巰基乙醇，0.3?mg/ml溶菌酶，5?mM咪唑，用氫氧化鈉調pH值至9.0；

（4）?將（3）中的上清液進行鎳瓊脂糖凝膠親和層析，依次用含有20?mM、50?mM、100?mM、250?mM咪唑的洗液進行梯度洗脫，將收集到的含有目的蛋白的洗脫液透析除鹽，并進行分裝。

作為一種優選方案，所述的一種可溶性HIV-1整合酶重組蛋白的制備方法，步驟（2）中的表達培養基含有25?g/L胰蛋白胨，15?g/L酵母提取物，2.5?g/L氯化鈉，1?g/L葡萄糖，12?g/L甘油，2.05?g/L磷酸氫二鈉，1.27?g/L磷酸二氫鈉，50?mg/L硫酸鎂，60?mg/L卡那霉素。

本發明中表達培養基、裂解緩沖液的各成分均可從生化試劑公司購得，并可按照本領域技術人員所通曉的常規方法配制而成。

本發明方法具有以下有益效果：

對傳統培養基進行改造，經過大量試驗，得到了優化的表達培養基。表達培養基中的各成分可保證宿主菌的正常生長和目的蛋白的高效表達，并能夠增加目的蛋白的可溶性及穩定性。其中，1?g/L的葡萄糖可阻止目的蛋白的過早表達；10-15?g/L的甘油可作為誘導表達后期的良好碳源，促進目的蛋白的表達；2.05?g/L的磷酸氫二鈉和1.27?g/L的磷酸二氫鈉可使培養基保持有利于菌體生長和目的蛋白表達的pH環境。裂解緩沖液的較高pH值可加強菌體的破碎效果，增加目的蛋白的可溶性，最終提高目的蛋白的產率。使用本發明方法，無需經過包涵體的變性復性等繁瑣程序，菌體破碎后可直接將上清液進行親和層析，獲得大量可溶性HIV-1整合酶重組蛋白。另外，本發明方法亦無需傳統的低溫長時誘導方式，縮短了目的蛋白的制備時間，提高了工作效率。

附圖說明

圖1是15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗結果，從左至右三列依次為現有方法菌體破碎后的上清液、本發明方法菌體破碎后的上清液、目的蛋白的條帶，被方框框出的條帶分別為現有方法、本發明方法菌體破碎后的上清液中的目的蛋白條帶。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明作進一步說明：

按照如下步驟制備可溶性HIV-1整合酶重組蛋白：