[發明專利]含硒重組人血白蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 201310188214.1
• 申請日: 2013-05-20
• 公開（公告）號: CN103468769A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 徐東;楊艷群
• 申請（專利權）人: 深圳市亞太興實業有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/36;C07K1/18;C07K1/30;C07K1/34
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種含硒重組人血白蛋白的制備方法。?

背景技術

人血清白蛋白在人血漿中含量極其豐富，是循環系統中用量最多的蛋白質，約占血漿總蛋白的60%，典型的血漿濃度HSA含量為50g/L，滲透壓占全部血漿的80％。正常人血清白蛋白水平為每100mL3.9～4.5g，當每100mL血漿中白蛋白水平低于3g時，就會發生全身水腫，當病人受外傷而發生腦壓升高，腦部水腫壓迫神經時，白蛋白是最重要的搶救手段。因此，人血清白蛋白在臨床上主要用于手術輸血和危重病人補液，治療創傷休克、發燒、水腫、低白蛋白血癥和紅細胞過多癥等，而且能增強人體抵抗能力，是重要的臨床藥物。HSA的主要作用是維持血液的正常滲透壓和運送許多親水分子(如類固醇激素，膽色素和脂肪酸等大量醫療分子）。另外，人血清白蛋白也應用在生物產品的制備上，如臨床和層析劑純化膽紅素，用做肝病毒疫苗和穩定劑等。目前市場上銷售的HSA商品均來自人源血漿提取純化。然而人血來源有限，艾滋病、乙肝等病毒的蔓延及檢測技術方面的原因，使得因使用該種血液制品而感染艾滋病及肝炎的情況時有發生，以致有的國家禁止國外血液制品的進口，這就對血源人血白蛋白的生產要求和質量控制更加嚴格。?

為了解決人血清白蛋白來源有限的矛盾，通過基因工程技術把人血清白蛋白基因克隆到微生物(細菌、真菌等)、動物、植物宿主上進行高效表達是最具有前景的方法，近20年以來，國際上許多實驗室和公司陸續嘗試通過遺傳工程開發HSA，國內也有多家單位已經開展了重組人血清白蛋白的研究，HSA基因已被引入細菌、真菌、植物以及動物中進行表達。rHSA在細菌表達中的表達?主要是在大腸桿菌E.coli和枯草桿菌Bacillus?subtilis兩種系統中的表達。rHSA在E?coli中表達量可達細胞總蛋白的7％，但因為血清白蛋白分子中含有大量的二硫鍵，使得胞外折疊很難正確完成，產物不具有生物活性，而且可能產生極個別的氨基酸序列變化；因而大腸桿菌蛋白表達量雖高，但應用到生產上意義不大。枯草桿菌作表達HSA時，產物聚集在細胞內或在胞外(細胞膜的外面)導致信號序列沒有被酶解，阻礙了外源蛋白的分泌途徑，使得表達量不高且信號肽去除率低，因而也不適合工業化生產。rHSA也可在大鼠，小鼠，山羊，奶牛等轉基因動物中得到表達，在體內試驗時，可通過微注射方法把HSA基因片斷注射到受精卵中，基因通過同源重組來表達完整的HSA；也可以通過中間受體基因傳送把HSA?DNA輸送到肝細胞中表達；另外，rHSA基因通過細胞外植培養也可進行分泌表達，在外植培養時能夠很快地誘導，但基因的表達調控受到胞外基質的雙重調控，操作復雜，FDA目前還沒有批準任何一家公司用轉基因動物生產的重組人血清白蛋白上市，動物細胞培養的高成本，也使得動物細胞的表達受到成本的限制；rHSA也可通過轉基因技術在馬鈴薯和煙葉中得到成功的分泌表達，但與同樣存在成本限制的問題。?

硒是生物體所必需的微量營養元素之一，它具有重要的生物學功能。生物體硒缺乏可導致40多種病癥，如人體的克山病、大骨節病和動物的白肌病等，因而補硒對生物體是非常必要的。近來的研究還表明，硒作為生物抗氧化劑，有清除有機體內的自由基，減少機體脂質過氧化反應的效應；硒具有抗癌和延緩衰老的作用；硒還有提高機體免疫活力的作用。此外，硒還對重金屬鹽如Hg、Ni、Pb、Cd等毒性有頡抗效應。研究證實，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH—Px)是哺乳動物體內最早確證其酶功能的含硒蛋白質，硒攝入量不足，血液中此酶的活性會下降。?

到目前為止，人類營養中硒的補充形式大致有2類：第1類是無機硒化合物，這在我國克山病區已收到了較好的效果，但是硒的無機化合物多具有毒性，使用劑量不慎極易引起不良副作用；第2類是人工合成的有機硒化合物，用于?注射，以期在體內逐漸釋放硒，起到長效作用，但是注射用藥的方式限制了它的應用。?

目前或獲取的蛋白質中，含有硒的較少，難以達到補硒的目的。?

發明內容

有鑒于此，本發明提供一種含硒重組人血白蛋白的制備方法，解決現有技術中人血白蛋白制備成本高、產量低，并且硒含量差的技術問題。?

本發明是這樣實現的，?

一種含硒重組人血白蛋白的制備方法，包括如下步驟：?

構建含重組人血白蛋白基因的畢赤酵母工程菌；?

將該畢赤酵母工程菌進行發酵培養；該發酵培養過程中向培養基中加入體積分數為0.001%～0.05%的亞硒酸鈉；?

將發酵培養的產物純化，得到含硒重組人血白蛋白。?