[發(fā)明專利]一種高效益生菌及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310188066.3
• 申請(qǐng)日: 2013-05-20
• 公開（公告）號(hào): CN104178441A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉志華;秦環(huán)龍;汪建平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 劉志華
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/74;A61K35/74;A01P1/00;C12R1/225;C12R1/245;C12R1/23;C12R1/25;C12R1/24;C12R1/01
• 代理公司: 上海精晟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高效益生菌，尤其涉及一種高表達(dá)I58基因的乳酸桿菌及其制備方法。

背景技術(shù)

益生菌是指改善宿主微生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，達(dá)到提高宿主健康水平和健康狀態(tài)的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物，其廣泛存在于地球上的各個(gè)角落，是一種對(duì)人和動(dòng)物有益的細(xì)菌，它們可直接作為食品添加劑服用，以維持腸道菌叢的平衡，在腸道內(nèi)的黏附和定植能抑制致病菌的損傷，對(duì)于保護(hù)腸道黏膜的完整性具有重要的意義；自90年代初以來，形形色色的“益生菌”類保健品風(fēng)靡了整個(gè)世界，與此同時(shí)，“益生菌”的研究業(yè)已成為國際上的熱門研究課題。

乳酸桿菌是益生菌中及其重要的一種，可以與靶細(xì)胞黏附，競(jìng)爭(zhēng)抑制致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）和侵襲性大腸桿菌（EIEC）等致病菌對(duì)人體腸道屏障功能的損害；激發(fā)繼發(fā)于黏附的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，降低腸上皮細(xì)胞（IEC）的通透性；調(diào)節(jié)人體腸道黏膜免疫功能，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞（DC）分化成熟，以及誘導(dǎo)腸道T細(xì)胞分化成熟等。

研究表明，益生菌包括乳酸桿菌對(duì)腸道炎癥性相關(guān)疾病，如炎癥性腸病、腸易激綜合征、抗生素相關(guān)性腹瀉、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、和膽道感染等，具有重要的防治作用。然而，益生菌在使用過程中也存低效性問題，即在病理狀態(tài)下，益生菌劑量較難在腸道長期維持一個(gè)較高的劑量。因此，建立高效能的益生菌對(duì)于腸道菌群失調(diào)引起的疾病的治療，以及新藥的開發(fā)具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種高效益生菌，能夠高表達(dá)I58基因（IMP501-580）。

本發(fā)明提供了一種高效益生菌，所述高效益生菌為高表達(dá)I58基因（IMP501-580）的乳酸桿菌。

優(yōu)選地，將含有I58基因的重組載體轉(zhuǎn)染乳酸桿菌中，得到高表達(dá)I58基因的乳酸桿菌。

優(yōu)選地，所述乳酸桿菌選自保加利亞乳桿菌、干酪乳酸菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧桿菌、短乳桿菌。

本發(fā)明還提供了一種制備上述高效益生菌的方法，包括以下步驟：

步驟1，依據(jù)I58基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，經(jīng)PCR克隆I58基因片段；

步驟2，將所得I58基因片段克隆至表達(dá)載體中，獲得重組載體；

步驟3，轉(zhuǎn)染所述重組載體至感受態(tài)的乳酸桿菌中，得到高效益生菌。

優(yōu)選地，在擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)過程中，使所設(shè)計(jì)的上游引物在I58基因上游引入Bgl?Ⅱ酶切位點(diǎn)；使所設(shè)計(jì)的下游引物在I58基因下游引入Xho?Ⅰ酶切位點(diǎn)。

優(yōu)選地，步驟1中所述擴(kuò)增引物如下：

上游引物：5’-atcAAGCTTTTTTCAGTTCAAAATGGTTA-3’；

下游引物：5’-atcctcgagAGTTTTCATCTTAACAACCT-3’；

其中所述上游引物中atc為Bgl?Ⅱ酶切位點(diǎn)，所述下游引物中atcctcgag為Xho?Ⅰ酶切位點(diǎn)。

優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為含有Bgl?Ⅱ酶切位點(diǎn)和Xho?Ⅰ酶切位點(diǎn)的表達(dá)載體。

優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為pET32載體。

優(yōu)選地，所述乳酸桿菌選自保加利亞乳桿菌、干酪乳酸菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧桿菌、短乳桿菌。

本發(fā)明還提供了上述高效益生菌在制備治療腸道菌群失調(diào)引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。

益生菌在腸道內(nèi)的黏附和定植對(duì)抑制病菌的定植、移位和感染，維護(hù)腸道黏膜的完整性具有特別重要的意義。乳酸桿菌是益生菌中重要的一類，其在發(fā)揮益生作用時(shí)，表面蛋白（surface?layer?protein，SLP）的黏附結(jié)構(gòu)起著核心作用。其中，乳酸桿菌表面蛋白的活性片段I58（IMP501-580）為具有黏附活性的片段。

本發(fā)明提供的高效益生菌能夠高表達(dá)I58基因，黏附活性高，不會(huì)發(fā)生易位，也不會(huì)與抗生素作用，故可以很好彌補(bǔ)普通乳酸桿菌易位和不耐抗生素的缺陷，抑制病菌的定植、移位和感染，因此臨床應(yīng)用價(jià)值較大，有著廣闊的醫(yī)藥應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為競(jìng)爭(zhēng)黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面參照附圖，結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明，以更好地理解本發(fā)明。

本實(shí)施例提供了一種高表達(dá)I58基因的高效益生菌，將含有I58基因的重組載體轉(zhuǎn)染乳酸桿菌中，得到高表達(dá)I58基因的乳酸桿菌。

制備方法具體為：

1、克隆I58基因

1.1基因組NDA的提取

1)抽提緩沖液65℃預(yù)熱；