[發(fā)明專利]用于快速檢測新型H7N9亞型禽流感病毒的多重熒光RT-PCR試劑盒及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310187844.7
• 申請日: 2013-05-20
• 公開（公告）號: CN103276110A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設計）人: 羅寶正;莫秋華;薄清如;徐海聶;楊澤;李儒曙;廖秀云;沙才華
• 申請（專利權）人: 珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

技術領域

本發(fā)明屬于分子檢測領域，具體涉及一種用于快速檢測新型H7N9亞型禽流感病毒的多重熒光RT-PCR試劑盒及方法。

背景技術

2013年3月底，在上海和安徽兩地先后發(fā)生禽流感病毒感染人的疫情，經過國家禽流感參考實驗室證實，此次禽流感由全球首次發(fā)現的H7N9新型流感病毒引起。截止到2013年5月1日16時，全國內地共報告127例確診病例，其中死亡26人，死亡率達到20.47%，在禽流感病毒各亞型中其死亡率僅次于H5N1（2003.1～2013.5，30/45，66.67%）。由于該亞型病毒的突發(fā)性、高死亡率及尚無有效預防治療措施，所以發(fā)生時對公共衛(wèi)生安全和社會的穩(wěn)定造成了很大的影響。

禽流感病毒（Avian?Influenza?Virus,AIV）屬于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）A型流感病毒屬，其基因組為8條單股負鏈RNA，可編碼HA、NA、M1、M2、NP、PA、PB1、PB2、NS1、NS210種病毒蛋白。根據病毒分子表面抗原血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經氨酸酶（Neuraminidase，NA）的抗原特性可分為16種HA（H1～H16）和10種NA（N1～N10），理論上可形成160種不同的禽流感病毒亞型，且各亞型之間通常無交叉免疫保護性。而且據實驗證實，不同亞型禽流感病毒同時感染一個細胞時，不同亞型的病毒基因組會發(fā)生片段重組，造成病毒變異。據Chen等報道此次發(fā)生的新型H7N9亞型禽流感病毒為新型重配病毒，其內部基因來自于中國存在的H9N2亞型的禽流感病毒，這也是該亞型病毒突發(fā)時現存免疫制劑無法起到保護作用的原因。本研究利用熒光RT-PCR反應的快速、靈敏及污染性小等特點，建立了基于TaqMan探針的多重熒光RT-PCR檢測方法，期望在新型H7N9亞型禽流感病毒的早期檢測中發(fā)揮作用。

發(fā)明內容

本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于快速檢測新型H7N9亞型禽流感病毒的多重熒光RT-PCR引物和探針。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用于快速檢測新型H7N9亞型禽流感病毒的多重熒光RT-PCR試劑盒。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種快速檢測新型H7N9亞型禽流感病毒的多重熒光RT-PCR方法。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

一種用于快速檢測新型H7N9亞型禽流感病毒的多重熒光RT-PCR引物和探針，其包括一組用于檢測H7亞型禽流感病毒的特異性引物和探針和一組用于檢測N9亞型禽流感病毒的特異性引物和探針，其中，

用于檢測H7亞型禽流感病毒的引物和探針如下所示：

H7F：TAGAATACAGATTGACCCAGTCAAA（SEQ?ID?NO:1），

H7R：CCCCGAAGCTAAACCAAAGT（SEQ?ID?NO:2），

H7P：FAM-TAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGA-BHQ1（SEQ?ID?NO:3）；

用于檢測N9亞型禽流感病毒的引物和探針如下所示：

N9F：GGAATAGCAAACCTAGGATTGAA（SEQ?ID?NO:4）；

N9R：GGTTGTGAGTGTGAGCAATTG（SEQ?ID?NO:5）；

N9P：HEX-TAGGACTGCATCTAAAACCGGGCT-BHQ1（SEQ?ID?NO:6）。

一種用于快速檢測新型H7N9亞型禽流感病毒的多重熒光RT-PCR試劑盒，其含有上述的引物組。

所述試劑盒中還含有反轉錄酶、Tap聚合酶、RT-PCR反應緩沖液、陽性標準品和陰性標準品。

所述陽性標準品為含有H7N9亞型禽流感病毒的血凝素抗原（HA）基因序列（GenBank：KC853766）的重組質粒和含有神經氨酸酶抗原(NA)基因序列（GenBank：KC853765）的重組質粒。

一種快速檢測新型H7N9亞型禽流感病毒的多重熒光RT-PCR方法，包括如下步驟：

（1）提取待檢樣品RNA；

（2）以待檢樣品RNA為模板，利用上述的引物和探針（SEQ?ID?NO:1～6）進行RT-PCR反應；

（3）結果判斷：根據擴增曲線，對照陽性標準品和陰性標準品的擴增結果，判斷樣品是否為新型H7N9亞型禽流感病毒。

本發(fā)明的有益效果是：