[發(fā)明專利]壬基酚聚氧乙烯醚檢測試劑盒及其制備和使用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310186034.X
• 申請日: 2013-05-17
• 公開（公告）號: CN103308685A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉付建;梁德沛;陳紀(jì)文;馮艷;郭新東;盧宇靖;黃金鳳
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院;廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院;廣東工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香;秦雪梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種化工添加劑檢測技術(shù)，具體來說，特別是涉及一種用于壬基酚聚氧乙烯醚含量檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備和使用方法。

背景技術(shù)

壬基酚聚氧乙烯醚（Nonylphenol?ethoxylate，NPE），是壬基酚的衍生物，烷基酚聚氧乙烯醚類化合物，是廣泛使用的非離子表面活性劑，易溶于水和醇，有各種不同的親水親油平衡值。壬基酚聚氧乙烯醚具有有良好的滲透能力、乳化能力，能抗酸、抗堿、抗硬水、抗還原、抗氧化等性能，在洗滌劑、印染、化工有廣泛的用途。壬基酚聚氧乙烯醚在自然環(huán)境中會分解成壬基酚。壬基酚是一種公認的環(huán)境激素，它能模擬雌激素，對生物的性發(fā)育產(chǎn)生影響，并且干擾生物的內(nèi)分泌，對生殖系統(tǒng)具有毒性。美國、加拿大、日本、澳大利亞等多國都明確禁止化妝品中使用壬基酚聚氧乙烯醚，我國也鼓勵將日化等使用其他化學(xué)品替換有毒有害原料（產(chǎn)品）壬基酚聚氧乙烯醚。因此，快速檢測壬基酚聚氧乙烯醚在化妝品和涂料中的含量是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明提供一種壬基酚聚氧乙烯醚檢測試劑盒和一種壬基酚聚氧乙烯醚檢測試劑盒的制備和使用方法，可以快速檢測壬基酚聚氧乙烯醚在化妝品和涂料中的含量。

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種壬基酚聚氧乙烯醚檢測試劑盒，主要包括：

1）包被壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原的酶標(biāo)板：所述酶標(biāo)板的每個微孔內(nèi)壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原的濃度為0.25-2.5μg/mL；

2）壬基酚聚氧乙烯醚單克隆抗體工作液：該壬基酚聚氧乙烯醚單克隆抗體工作液的濃度為0.25-2.5μg/mL；

所述壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原與壬基酚聚氧乙烯醚單克隆抗體的用量為1:1。

在其中一個實施例中，所述壬基酚聚氧乙烯醚檢測試劑盒還包括有酶標(biāo)二抗，所述酶標(biāo)二抗是濃度按1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗。

在其中一個實施例中，所述壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原的濃度為1μg/mL；所述壬基酚聚氧乙烯醚單克隆抗體的濃度為2μg/mL。

在其中一個實施例中，所述壬基酚聚氧乙烯醚檢測試劑盒還包括壬基酚聚氧乙烯醚標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液、封閉液和濃縮樣品稀釋液。

在其中一個實施例中，所述壬基酚聚氧乙烯醚標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為0，0.5，1.5，4.5，10.0，20.0，45.0μg/L；所述底物顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，所述顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為2mol/L的硫酸溶液；所述洗滌液為含有0.05%-0.5%吐溫-20的0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮樣品稀釋液為0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述封閉液為含5%脫脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種上述壬基酚聚氧乙烯醚檢測試劑盒的制備方法，主要包括以下步驟：

1）制備壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原

將壬基酚聚氧乙烯醚分散于二氯甲烷中，加入甲磺酰氯和三乙胺，甲磺化反應(yīng)，得到甲磺壬基酚聚氧乙烯；然后再將該甲磺壬基酚聚氧乙烯分散于無水乙醇中，加入乙二胺，胺化反應(yīng)，制得能夠與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的氨基化壬基酚聚氧乙烯醚半抗原;在N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺的催化下，再與載體蛋白偶聯(lián)，制得壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原；所述的載體蛋白為牛血清蛋白、鑰孔嘁血藍蛋白或卵清蛋白；

2）包被酶標(biāo)板

將上述壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原包被于酶標(biāo)板中，所述酶標(biāo)板的每個微孔內(nèi)壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原的濃度為0.25-2.5μg/mL；

3）動物免疫

以步驟1）中合成的壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原為免疫原免疫小鼠，取免疫小鼠的血清，檢測該血清抗壬基酚聚氧乙烯醚的效價和抑制價，選取效價和抑制價最高的免疫小鼠；

4）細胞融合與篩選

取步驟3）所得免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞，得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細胞株，并取不完全佐劑腹腔注射進行致敏后的小鼠，將雜交瘤細胞混懸液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化，得到純化的壬基酚聚氧乙烯醚單克隆抗體；制備濃度為0.25-2.5μg/mL的壬基酚聚氧乙烯醚單克隆抗體工作液。