[發明專利]壬基酚聚氧乙烯醚檢測試劑盒及其制備和使用方法

有效

• 申請號: 201310186034.X
• 申請日: 2013-05-17
• 公開（公告）號: CN103308685A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 劉付建;梁德沛;陳紀文;馮艷;郭新東;盧宇靖;黃金鳳
• 申請（專利權）人: 廣東產品質量監督檢驗研究院;廣州市質量監督檢測研究院;廣東工業大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香;秦雪梅

1.一種壬基酚聚氧乙烯醚檢測試劑盒，其特征在于，主要包括：

1）包被壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原的酶標板：所述酶標板的每個微孔內壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原的濃度為0.25-2.5μg/mL；

2）壬基酚聚氧乙烯醚單克隆抗體工作液：該壬基酚聚氧乙烯醚單克隆抗體工作液的濃度為0.25-2.5μg/mL；

所述壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原與壬基酚聚氧乙烯醚單克隆抗體的用量為1:1。

2.根據權利要求1所述的壬基酚聚氧乙烯醚檢測試劑盒，其特征在于，還包括有酶標二抗，所述酶標二抗是濃度按1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗。

3.根據權利要求1所述的壬基酚聚氧乙烯醚檢測試劑盒，其特征在于，所述壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原的濃度為1μg/mL；所述壬基酚聚氧乙烯醚單克隆抗體的濃度為2μg/mL。

4.根據權利要求1所述的壬基酚聚氧乙烯醚檢測試劑盒，其特征在于，還包括壬基酚聚氧乙烯醚標準品溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液、封閉液和濃縮樣品稀釋液。

5.根據權利要求4所述的壬基酚聚氧乙烯醚檢測試劑盒，其特征在于，所述壬基酚聚氧乙烯醚標準品溶液濃度分別為0μg/L，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，10.0μg/L，20.0μg/L，45.0μg/L；所述底物顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，所述顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺；所述終止液為2mol/L的硫酸溶液；所述洗滌液為含有0.05%-0.5%吐溫-20的0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮樣品稀釋液為0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述封閉液為含5%脫脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液。

6.權利要求1-5任一項的壬基酚聚氧乙烯醚檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，主要包括以下步驟：

1）制備壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原

將壬基酚聚氧乙烯醚分散于二氯甲烷中，加入甲磺酰氯和三乙胺，甲磺化反應，得到甲磺壬基酚聚氧乙烯；然后再將該甲磺壬基酚聚氧乙烯分散于無水乙醇中，加入乙二胺，胺化反應，制得能夠與蛋白質偶聯的氨基化壬基酚聚氧乙烯醚半抗原;在N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺的催化下，再與載體蛋白偶聯，制得壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原；所述的載體蛋白為牛血清蛋白、鑰孔嘁血藍蛋白或卵清蛋白；

2）包被酶標板

將上述壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原包被于酶標板中，所述酶標板的每個微孔內壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原的濃度為0.25-2.5μg/mL；

3）動物免疫

以步驟1）中合成的壬基酚聚氧乙烯醚特異性抗原為免疫原免疫小鼠，取免疫小鼠的血清，檢測該血清抗壬基酚聚氧乙烯醚的效價和抑制價，選取效價和抑制價最高的免疫小鼠；

4）細胞融合與篩選

取步驟3）所得免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞，得到完全同質的單克隆抗體和穩定的單克隆雜交瘤細胞株，并取不完全佐劑腹腔注射進行致敏后的小鼠，將雜交瘤細胞混懸液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，經辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化，得到純化的壬基酚聚氧乙烯醚單克隆抗體；制備濃度為0.25-2.5μg/mL的壬基酚聚氧乙烯醚單克隆抗體工作液。