[發(fā)明專利]全氟三乙胺乳液與種子細胞復合的神經導管制備方法

有效

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• 申請日: 2013-05-17
• 公開（公告）號: CN103263695A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發(fā)明（設計）人: 羅卓荊;黃景輝;馬騰;王宇清;朱澍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
• 主分類號: A61L27/50
• 分類號: A61L27/50;A61L27/24;A61L27/20;A61L27/38
• 代理公司: 西安弘理專利事務所 61214
• 代理人: 羅笛

技術領域

本發(fā)明屬于長節(jié)段外周神經損傷修復技術領域，涉及一種全氟三乙胺乳液與種子細胞復合的神經導管制備方法。

背景技術

周圍神經損傷，尤其是長節(jié)段的周圍神經缺損的修復以及功能重建一直是再生醫(yī)學領域研究的重大課題。

雖然周圍神經具有再生的能力，但這種再生能力的效能較低，容易被周圍的疤痕所阻擋，從而使再生軸突分散，最終形成神經瘤。當前，自體神經移植被認為是治療周圍神經損傷或病灶切除后造成缺損的最有效的方法。然而，這種組織移植方法往往伴有供區(qū)新的創(chuàng)傷、免疫排斥反應或受到供區(qū)或供體其他許多條件的限制，以至于不能達到理想的修復效果。因此，人工組織工程神經支架則成為了解決這一問題的重要手段之一。

眾所周知，組織工程支架、種子細胞和生長因子（或生物反應器）是組織工程的三大要素。其中，組織工程支架和種子細胞是其中最重要的兩個因素。將功能性種子細胞接種到支架中修復組織缺損，往往能達到類似于自體組織移植的良好修復效果。因此，功能性的接種有種子細胞的神經支架具有非常可觀的臨床應用前景。然而，隨著研究的進一步深入，學者們發(fā)現(xiàn)當組織的體積達到數(shù)立方毫米時，其內部的細胞將難以通過滲透作用獲得營養(yǎng)和氧分的支持。如何才能夠保證接種到神經組織工程支架中的功能性細胞既能夠大量、均勻的分布，又能夠保持良好的活性和功能狀態(tài)，成為了目前一個急需要解決的問題。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種全氟三乙胺乳液與種子細胞復合的神經導管制備方法，解決了現(xiàn)有神經導管聯(lián)合種子細胞修復長節(jié)段神經缺損時出現(xiàn)的早期氧供不足的問題。

本發(fā)明所采用的技術方案是，全氟三乙胺乳液與種子細胞復合的神經導管制備方法，具體按照以下步驟實施：

步驟1、制備多微孔可降解膠原-殼聚糖神經導管；

步驟2、采用京尼平和乙醇混合溶液對經步驟1制得的多微孔可降解膠原-殼聚糖神經導管進行交聯(lián)及消毒處理；

步驟3、種子細胞的培養(yǎng)與純化；

步驟4、制備無菌的全氟三乙胺乳液；

步驟5、將經步驟4配制的全氟三乙胺乳液與經步驟3得到的種子細胞混合，并用雙筒等量注射器注射到步驟2得到的消毒后的多微孔可降解膠原-殼聚糖神經導管內，得到本發(fā)明的全氟三丁胺乳液與種子細胞復合的神經導管。

本發(fā)明的特點還在于，

步驟1具體按照以下步驟實施：

步驟1.1、分別稱取I型膠原蛋白和殼聚糖，I型膠原蛋白和殼聚糖的質量比為1～8:1；

步驟1.2、將經步驟1.1稱取的I型膠原蛋白放入冰醋酸中，將殼聚糖放入配制的醋酸溶液中，待I型膠原蛋白和殼聚糖都充分溶解后形成兩種懸濁液，混合兩種懸濁液配制出I型膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液；

步驟1.3、將經步驟1.2.4配制的I型膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液倒入神經導管成形模具中，進行注模和冷淋固形處理；

步驟1.4、制備出多微孔可降解膠原-殼聚糖神經導管。

步驟1.2具體按照以下步驟實施：

步驟1.2.1、配制質量體積百分比濃度為140mg/ml醋酸溶液；

步驟1.2.2、按步驟1.1中稱取的I型膠原蛋白的質量取冰醋酸，每克I型膠原蛋白加入10ml的冰醋酸溶液，將量取的冰醋酸與I型膠原蛋白混合，經22h～26h的溶解處理，制得I型膠原蛋白和冰醋酸的懸濁液；

按步驟1.1中稱取的殼聚糖的質量取步驟1.2.1中配制的醋酸溶液，每克的殼聚糖加入37ml的冰醋酸溶液，將量取的醋酸溶液與殼聚糖混合，經22h～26h的溶解處理，制得殼聚糖和醋酸的懸濁液；

步驟1.2.3、將經步驟1.2.2得到的I型膠原蛋白和醋酸的懸濁液與殼聚糖和醋酸的懸濁液混合在一起，于2℃～6℃條件下，恒溫攪拌處理70min～110min，得到混合懸濁液；

步驟1.2.4、將經步驟1.2.3得到的混合懸濁液先進行抽真空處理，之后再靜置10h～14h，得到I型膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液。

步驟1.3具體按照以下步驟實施：

步驟1.3.1、將經步驟1.2.4得到的I型膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液注入神經導管成形模具中，以小鐵夾固定神經導管成形模具的兩端；

步驟1.3.2、在微型調速儀作用下，以垂釣的方式將神經導管成形模具順軸向以1.2×10^-3m/s的速度緩慢浸入液氮中，對注入神經導管成形模具中的I型膠原-殼聚糖凝膠狀懸濁液進行冷淋固形處理，待神經導管成形模具完全浸入液氮后，繼續(xù)在液氮中保留10h～14h；