[發明專利]一種快速檢測食品中鴨源性成分的方法

有效

• 申請號: 201310185234.3
• 申請日: 2013-05-16
• 公開（公告）號: CN103224989A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發明（設計）人: 黃明;程欣;黃繼超;周興虎;楊靜
• 申請（專利權）人: 南京吉泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

技術領域

本發明屬于食品安全檢測技術領域，涉及一種快速檢測食品中鴨源性成分的方法，具體為一種添加擴增內標的食品中鴨源性成分TaqMan探針實時熒光PCR快速檢測方法。

背景技術

近年來，肉品的質量安全問題已經成為全社會關注的熱點話題。在經濟利益的驅使下，一些不法分子為牟取暴利而摻雜使假，將相對廉價的鴨肉、豬肉等深加工后冒充牛羊肉進行銷售，這些行為不僅損害牛羊產品質量，對穆斯林產生了巨大傷害，還極可能引入過敏原危害消費者健康，也會對牛羊產品在國際上的聲譽造成損害，2013年歐洲多國出現的“馬肉風波”也為我們敲響了警鐘。因此，對于摻假牛羊肉制品中較常出現鴨肉，建立科學、準確快速的檢測方法十分必要。

以前人們通常依靠感官和經驗鑒別肉的種類，隨著現代分子生物學的發展，逐步形成了分別以蛋白質檢測與核酸檢測為基礎的方法體系。近幾年來，根據不同物種基因序列的差異位點設計特異性引物，利用PCR反應實現特異性基因片段的擴增，繼而通過電泳檢測鑒別食品中動物源性成分的PCR方法已基本取代以蛋白檢測為基礎的鑒別技術。尤其是近5年出現的實時熒光PCR技術，以其高特異性、高靈敏性、無污染和可定量等優點，越來越多的應用于食品中的肉類鑒別。實時熒光PCR是利用PCR反應體系中熒光信號的變化對產物生成進行實時監測的技術，它不僅省去了凝膠電泳的繁瑣操作，減少了假陽性的發生率，還可以避免實驗過程中溴化乙錠對人體的潛在危害。在目標基因選擇方面，動物細胞核基因組DNA序列具有高度的物種特異性，能夠避免非特異性擴增；此外，目前對食品中動物源性的熒光定量PCR檢測研究均缺乏陽性擴增內標（IAC）對反應體系進行監測，無法避免檢測假陰性結果的產生，導致檢測結果不準確。目前國際上以細胞核基因DNA序列為目標基因，并添加有擴增內標的食品中動物源性熒光定量PCR檢測方法尚未見報道。因此，建立添加有擴增內標的食品中動物源性成分的實時熒光PCR快速檢測方法將對食品安全的監管具有重要的實踐意義。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種快速檢測食品中鴨源性成分的方法，以鴨的細胞核中基因序列為目標序列，設計特異性引物和TaqMan探針，設計并構建擴增內標，針對內標設計TaqMan探針，通過對PCR反應體系和反應條件的優化，建立用于檢測食品中鴨肉成分的添加有擴增內標的的熒光PCR方法。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種快速檢測食品中鴨源性成分的方法，為TaqMan探針熒光定量PCR方法，具體包括：以含有待檢DNA模板、含有陽性擴增內標DNA的重組質粒、陽性擴增內標DNA的TaqMan探針、鴨的IL-2基因擴增引物和TaqMan探針，進行熒光定量PCR反應；應用ABI?7500?Software?SDS1.4對結果進行分析處理，以Ct值小于36的擴增作為檢測的陽性結果；

其中，

陽性擴增內標DNA的序列如SEQ?ID?NO.1所示，陽性擴增內標DNA的TaqMan探針為：5’-CY5-ATGACCAAAGCCTCCGGGCGTAG-BHQ3-3’；

鴨的IL-2基因擴增上游引物序列為：5’-GGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACA-3’，下游引物序列為：5’-GTGTGTAGAGCTCAAGATCAATCCC-3’，探針為5’-FAM-TGGGAACAAGCATGAATGTAAGTGGATGGT-BHQ1-3’。

所述含有陽性擴增內標DNA的重組質粒，由以下方法制備：使用DNA隨機生成軟件產生一段DNA序列，并確保在NCBI中Blast后沒有出現與所述DNA序列同源的DNA片段；先在所述DNA序列上、下游分別連接上鴨的擴增引物序列，然后分別連接載體pMD19-T?Simple，再轉化感受態細胞E.coli?Competent?Cell?JM109，小量提取并測序驗證，得到含有陽性擴增內標DNA的重組質粒；其中，

所述TaqMan探針熒光定量PCR方法，20μL反應體系為：2μL待檢模板DNA，2μL含有陽性擴增內標DNA的重組質粒，10μL?Premix?Ex?Taq，0.8μL（10μM）鴨DNA探針溶液，0.8μL（10μM）擴增內標探針溶液，0.4μL?ROX校正溶液，上、下游引物各為0.4μL（10μM），滅菌蒸餾水補足。

所述TaqMan探針熒光定量PCR方法，反應條件為：95℃，30s；?95℃，5s，60℃，34s，40個循環。