[發明專利]一種降低金線蓮組培污染率的方法及其培養基配方

有效

• 申請號: 201310184747.2
• 申請日: 2013-05-16
• 公開（公告）號: CN103250644A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 邵清松;胡潤淮;王瑩;季宗富;易浩君
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學;杭州韻和生物科技有限公司;杭州語萊農業科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司 33101
• 代理人: 王洪新

技術領域

本發明屬于植物組織培養技術領域，具體涉及一種降低金線蓮組培污染率的方法及其培養基配方。

背景技術

金線蓮（Anoectochilus?roxburghii）又名金絲草，為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，是我國傳統名貴中藥，具有清熱涼血、除濕解毒等功效，用于治療糖尿病、腎炎、膀胱炎等癥，在民間享有“藥王”的美稱。浙南、閩臺及兩廣一帶長期用金線蓮煮水、泡茶、煲湯，用于強身健體、滋補調養。現代研究表明金線蓮中含有多糖、黃酮類、強心苷類等多種成分，可增強人體免疫力，提高機體抵抗力、防止疾病的侵襲，增強并改善體質等功效。

金線蓮長期以來依靠采挖收集野生資源，而野生金線蓮繁殖率極低，致使資源蘊藏量迅速下降，部分傳統產區已無藥可采。金線蓮種苗是其栽培的關鍵環節，種苗的優劣直接關系到金線蓮的生長發育、產量和品質。由于金線蓮種子不具胚乳，無發芽能力，只有在真菌共生下，才能促使其種子萌發生長，所以生產上主要采用莖段繁育種苗。但是在組培生產過程中由于細菌、真菌等微生物引起的污染問題（污染率一般為20%以上）一直是當前制約金線蓮種苗繁育的主要障礙。污染初期會導致增殖效率的降低，培養材料生長延緩；污染后期會導致組培苗移栽困難和死亡，甚至有的會引起培養材料的遺傳變異。因此尋找一種降低金線蓮組培污染率的方法及其培養基對于提高組培成功率、降低成本、提高經濟效益等都具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是克服上述背景技術存在的不足，提供一種降低金線蓮組培污染率的方法及其培養基配方的技術方案。

本發明提供的技術方案是：

一種降低金線蓮組培污染率的培養基配方，其特征在于所述的培養基配方為1/2MS、香蕉40～60g/L、活性炭0.8～1.2g/L、NAA0.8～1.2mg/L、6-BA0.4～0.8mg/L、蔗糖22～30g/L、瓊脂粉5.5～6.5g/L、洋蔥40～60g/L、螃蟹殼粉10～20g/L。

所述的一種降低金線蓮組培污染率的培養基配方，其特征在于所述的培養基配方為1/2MS、香蕉50g/L、活性炭1.0g/L、NAA1.0mg/L、6-BA0.6mg/L、蔗糖26g/L、瓊脂粉6.0g/L、洋蔥50g/L、螃蟹殼粉15g/L。

培養基配方降低金線蓮組培污染率的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）接種室消毒：每月內用艾葉和雷公藤對接種室薰蒸一次進行滅菌消毒；每周內用臭氧發生器對接種室進行一次滅菌消毒；

2）培養室消毒：每月用艾葉和雷公藤對培養室薰蒸一次進行滅菌消毒；每周用臭氧發生器對培養室進行一次滅菌消毒；

3）培養基配制：以1/2MS為基礎培養基，按照配方進行配制，混勻后將培養基的PH值調節至5.8～6.0；將配制好的培養基加熱至瓊脂完全溶解，趁熱分裝于干凈的培養瓶中后加蓋；

4）培養基和接種器具滅菌：采用高壓蒸汽法對培養基和接種器具進行滅菌。

5）外植體接種：

當采用自然生長的金線蓮植株作為外植體時，用自來水洗凈金線蓮，轉入70%乙醇漂洗30s，再用0.1%升汞滅菌10min，無菌水反復沖洗5～6次，瀝干水分，剪成帶1個節莖段，接種于準備好的培養基上；

當采用金線蓮組培無菌苗作為外植體時，將金線蓮剪成帶1個節莖段，接種于準備好的培養基上；

6）組培苗培養：將接種好的培養瓶移入培養室，培養條件：溫度24±2℃，光照時間12h/d，光照強度1800～2000lx，培養時間四個月。

所述的培養室應定期打掃，每天噴灑75%的酒精除塵，陰雨天開空調除濕，以保持干凈和室內空氣干燥；發現培養室有污染的培養瓶應立即滅菌處理，以防擴散。接種前，接種室和超凈工作臺開紫外燈照射消毒30min，然后打開超凈工作臺吹風20min，用新潔爾滅擦拭臺面后使用；污染的培養瓶須經過高溫高壓滅菌后方可使用。

所述步驟4）滅菌時要保證滅菌鍋內部清潔，內部的冷氣排盡，裝填的滅菌物不能堆放過滿，保持滅菌鍋溫度在121℃、105kPa、20min；培養基滅菌后，先放入緩沖間，抽取樣品放在培養室培養2～3d，若培養基表面和內部均無任何細菌痕跡和真菌菌斑，方可使用；刀、剪、鑷子等金屬用具在接種前用75%酒精棉球擦拭，再在帶有石英砂的消毒器內高溫消毒5～10min，冷卻后使用。