[發明專利]一種黃曲霉菌遺傳轉化表達載體的構建方法

無效

• 申請號: 201310182865.X
• 申請日: 2013-05-16
• 公開（公告）號: CN103224950A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發明（設計）人: 陶芳;范軍;儲韜;張心雨;魏洪璇
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/66;C12R1/67
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務所 34116
• 代理人: 胡敏

技術領域

本發明涉及一種黃曲霉菌遺傳轉化表達載體的構建方法。

背景技術

本發明構建的表達載體適用于黃曲霉菌遺傳轉化研究，特別適用于黃曲霉菌相關功能基因的研究，以及監測黃曲霉菌對農作物和食品的侵染過程。也可用于其它真菌的遺傳轉化研究。

背景技術

黃曲霉常侵染玉米、花生、大米、棉籽等糧油作物及其制品，其分泌的兩種毒素AFB1、AFB2對家畜、動物和人類健康構成極大的潛在危害。該菌的基因組已測序，對它的研究進入了功能基因組時代。目前黃曲霉的轉基因研究主要采用PEG法，此方法有以下不足：一、需要制備原生質體。除了制備原生質體過程復雜，重復性差外，此方法最大的問題在于轉化子不穩定，轉化效率低。二、這種方法轉化的多是黃曲霉營養缺陷型菌株，即突變后的菌株，而非野生菌株。在目標突變產生的同時，一些潛在的不易檢測到的突變可能會影響后期對功能基因的研究。

在眾多以獲得真菌突變體為目的的技術中，農桿菌介導的遺傳轉化具有效率高，成本低，操作方便和重復性好等特點，為真菌的功能基因組研究提供了有力的工具，到目前為止已在30多種真菌上取得成功。但至今尚無農桿菌介導轉化黃曲霉菌的報道，是因為真菌遺傳轉化廣泛使用的是植物雙元表達載體，大多采用潮霉素抗性標記，而黃曲霉菌對潮霉素敏感性較差，在篩選階段需加入大量的潮霉素，成本較高，費時費力；且多數黃曲霉菌株抗潮霉素，無法進行篩選。

熒光報告蛋白，尤其是綠色熒光蛋白GFP，已被廣泛用于轉基因后代的篩選，能有效提高篩選效率。但對一些綠色熒光本底較高的宿主，則給轉化子鑒定及監測真菌和宿主的相互作用帶來困難。此外，將篩選標記基因與熒光報告基因構建于同一個載體，同時轉化真菌已有應用，但多為潮霉素抗性標記和綠色熒光GFP基因，分屬于2個表達盒，致使最后的表達載體T-DNA插入區較大，影響轉化效率，目前在黃曲霉菌中尚無有關報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種黃曲霉菌遺傳轉化表達載體的構建方法。

本發明是通過以下技術方案來實現的。

一種黃曲霉菌遺傳轉化表達載體的構建方法，包括步驟：

（1）以pAF2載體為模板，以引物①：TAGGATCCATGGCCAAGTTGACCAGTG和引物②：acttccgctaccaccGTCCTGCTCCTCGGCCAC對上述pAF2載體模板進行PCR擴增獲得ble基因片段；

（2）以含玉米upmt基因的質粒pUC-upmt載體為模板，以引物③：ggtggtagcggaagtCAGCTGCCGGAACTGCGG和引物④：GCTCTGCAGCTATGACTCAACCCAGAAG對上述pUC-upmt載體模板進行PCR擴增獲得upmt基因片段；

（3）將上述ble基因片段、upmt基因片段等量混合作為模板，以引物①④擴增獲得融合基因ble-upmt；

（4）將上述融合基因ble-upmt使用BamHI和PstI雙酶切，插入經相同酶切的pUC18載體，構建成pUC-ble-upmt載體；

（5）以pAN7-1載體為模板，以引物⑤：ATACTGCAGCCGCGGGATCCACTTAACG和引物⑥：CGCAAGCTTTCGAGTGGAGATGTGGAG，PCR擴增trpc終止子片段，經PstI和HindIII雙酶切后，插入上述pUC-ble-upmt載體，構建成pUC-ble-upmt-trpc載體；

（6）以pAN7-1載體為模板，以引物⑦：?GCGAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG和引物⑧CTAGGTACCGTTCTTGGATGGGAAGATG，PCR擴增gpdA啟動子，經EcoRI和KpnI雙酶切后，插入上述pUC-ble-upmt-trpc載體，構建成pUC-gpdA-ble-upmt-trpc載體；

（7）將上述pUC-gpdA-ble-upmt-trpc載體轉入Ecoli.?DH5α感受態細胞，篩選陽性轉化子；