[發明專利]一種黃曲霉菌遺傳轉化表達載體的構建方法

無效

• 申請號: 201310182865.X
• 申請日: 2013-05-16
• 公開（公告）號: CN103224950A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發明（設計）人: 陶芳;范軍;儲韜;張心雨;魏洪璇
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/66;C12R1/67
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務所 34116
• 代理人: 胡敏

1.一種黃曲霉菌遺傳轉化表達載體的構建方法，其特征在于，包括步驟：

（1）以pAF2載體為模板，以引物①：TAGGATCCATGGCCAAGTTGACCAGTG和引物②：acttccgctaccaccGTCCTGCTCCTCGGCCAC對所述pAF2載體模板進行PCR擴增獲得ble基因片段；

（2）以含玉米upmt基因的質粒pUC-upmt載體為模板，以引物③：ggtggtagcggaagtCAGCTGCCGGAACTGCGG和引物④：GCTCTGCAGCTATGACTCAACCCAGAAG對所述pAF2載體模板進行PCR擴增獲得upmt基因片段；

（3）將所述ble基因片段、upmt基因片段等量混合作為模板，以引物①④擴增獲得融合基因ble-upmt；

（4）將所述融合基因ble-upmt使用BamHI和PstI雙酶切，插入經相同酶切的pUC18載體，構建成pUC-ble-upmt載體；

（5）以pAN7-1載體為模板，以引物⑤：ATACTGCAGCCGCGGGATCCACTTAACG和引物⑥：CGCAAGCTTTCGAGTGGAGATGTGGAG，PCR擴增trpc終止子片段，經PstI和HindIII雙酶切后，插入所述pUC-ble-upmt載體，構建成pUC-ble-upmt-trpc載體；

（6）以pAN7-1載體為模板，以引物⑦：?GCGAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG和引物⑧CTAGGTACCGTTCTTGGATGGGAAGATG，PCR擴增gpdA啟動子，經EcoRI和KpnI雙酶切后，插入所述pUC-ble-upmt-trpc載體，構建成pUC-gpdA-ble-upmt-trpc載體；

（7）將所述pUC-gpdA-ble-upmt-trpc載體轉入Ecoli.?DH5α感受態細胞，篩選陽性轉化子；

（8）將pCAMBIA1300載體經XhoI和BstXI雙酶切，去除原載體上的CaMV35S啟動子和hph基因，凝膠電泳回收大片段，加大腸桿菌DNA?polymerase?I于15℃反應2h補平末端，80℃保溫5min滅活，用PCR產物純化試劑盒回收片段，并于4℃連接16h，將連接產物轉化Ecoli.?DH5α，篩選陽性轉化子；

（9））將所述pUC-gpdA-ble-upmt-trpc的用EcoRI和?HindIII雙酶切，插入所述改造后的pCAMBIA1300的陽性轉化子載體中。

2.根據權利要求1所述的黃曲霉菌遺傳轉化表達載體的構建方法，其特征在于，所述步驟（7）中，pUC-gpdA-ble-upmt-trpc載體轉入Ecoli.?DH5α感受態細胞是采用熱擊法轉入。

3.根據權利要求1所述的黃曲霉菌遺傳轉化表達載體的構建方法，其特征在于，所述步驟（7）中，篩選陽性轉化子是在含Amp抗生素的LB平板上進行篩選的。

4.根據權利要求1所述的黃曲霉菌遺傳轉化表達載體的構建方法，其特征在于，所述步驟（8）中，篩選陽性轉化子是在含Kan抗生素的LB平板上進行篩選的。