[發明專利]一種用于微量蛋白檢測的微芯片的制備方法

有效

• 申請號: 201310182719.7
• 申請日: 2013-05-16
• 公開（公告）號: CN103278643A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 張宏蓮;李剛;廖玲英;毛紅菊;金慶輝;趙建龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海微系統與信息技術研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

技術領域

本發明屬于血漿分離和蛋白質的檢測領域，特別涉及一種用于微量蛋白檢測的微芯片的制備方法。

背景技術

全血是由液態血漿、紅細胞、白細胞、血小板等成份組成。在現代醫學檢測中，由于血細胞或者血紅素對光譜分析存在很大的干擾，通常都首先把血漿從血液樣品中分離出來，然后用于生化或免疫診斷分析。目前，離心法和過濾法是臨床中使用最普遍的方法。離心法是利用慣性離心力和物質沉降系數的原理來達到分離效果，而過濾法是通過濾膜或固體支撐物來實現血漿的分離。但這兩種方法都存在一定的不足之處，前者分離設備體積龐大、操作復雜，后者濾膜孔容易被血細胞堵塞導致分離效率降低和樣品污染。因此，如何有效地將血漿從全血中分離并與檢測有機地結為一體是研究的熱點。

近年來，微全分析系統因具有微型化、集成化和智能化的特點而備受研究者關注，尤其是分析速度快、所需樣品量為幾微升或更低，所以微全分析系統將為生物醫學、分析化學提供更好的檢測平臺。微流控技術是微全分析系統的核心，微芯片尺寸在厘米量級，采用MEMS技術在硅片、玻璃或塑料等基底材料上制造出通道網絡、反應混合池、檢測器等元器件集一體的多功能芯片。因此，在微芯片上實現微量樣品的分離與檢測一直是大家關注的焦點。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種用于微量蛋白檢測的微芯片的制備方法，該微芯片將全血中血漿的分離、檢測連接為一體，可以一次針對多個靶目標的檢測，具有特異、快速和高靈敏的特點，并且不需要復雜的儀器以及酶反應的實驗條件，可望應用于臨床中微量全血中多種蛋白的診斷和檢測。

本發明的一種用于微量蛋白檢測的微芯片的制備方法，包括：

以硅片為基底材料，以SU-8光刻膠作為掩模層，分別曝光、顯影制作固定蛋白的模具A和分離檢測模具B；將PDMS和固化劑（Sylgard184curing?agent）以重量比5～10：1混合后，分別澆注在模具A和模具B上，加熱固化；分別剝離模具A上的PDMS結構A-PDMS、模具B上的PDMS結構B-PDMS；A-PDMS打進樣孔和出樣孔后，與經過處理的玻璃片貼合，用于固定多個抗體；將A-PDMS揭掉后，將固定有抗體的玻璃片與B-PDMS對準貼合，并取另一經打孔的玻璃片貼合在B-PDMS的另一面，構成玻璃-PDMS-玻璃的夾心結構，即得微芯片。

所述A-PDMS的尺寸為100μm高×100μm寬。

所述B-PDMS包括血漿分離管道、細胞沉積管道和廢液池，其中血漿分離管道的尺寸為15μm×100μm×23mm，細胞沉積管道的尺寸為100μm×500μm×20mm，廢液池的尺寸為100μm×1.6mm×9mm。

所述加熱固化的溫度為90℃，固化的時間為1小時。

所述經過處理的玻璃片為經過醛基修飾的玻璃片。

所述固定多個抗體的溫度為37℃，時間為2小時；其中，多個抗體具體為BSA、CEA、CyFRA21-1和IgG抗體。

所述微量蛋白檢測中的微量蛋白為抗原或抗體。

所述得到的微芯片配合納米金標記抗體應用于全血中血漿的分離和蛋白質的檢測；具體步驟包括如下：

納米金標記單克隆二抗NP與樣品混合后，加入微芯片的進樣口，通過分離區域時血細胞沉積，同時血漿和NP流入檢測區域，與芯片上固定的單克隆一抗形成NP-抗原-一抗夾心結構，從而造成信號放大，通過納米金顯色得出結果。

所述納米金標記抗體的制備方法包括：

（1）配置濃度為1mM?HAuCl₄溶液及濃度為38.8mM的檸檬酸三鈉溶液，將HAuCl₄溶液加熱至130℃，20分鐘時加入25ml檸檬酸三鈉溶液，持續攪拌至溶液冷卻至室溫，即形成為酒紅色溶液；以0.22μm硝酸纖維尼龍膜過濾溶液，即可得到顆粒均勻的13nm納米金溶液，4℃保存備用；

（2）取500μl的上述納米金溶液，用碳酸鉀調節pH為8.2，加入30μl的二抗，放置1～2個小時后多次加入4μl的0.1M?NaCl和0.01M?PB，4℃保存。

步驟（2）中的納米金溶液濃度為12.2nM，二抗的濃度為0.1mg/ml。

本發明微流體芯片（簡稱微芯片）中微結構的示意圖如圖2所示。利用標準的光刻工藝實現微結構的制作，用玻璃片與微結構可逆封接制備了所需的微芯片。該微芯片將全血中血漿的分離和蛋白質檢測連接為一體。整個芯片大小為75mm×25mm,由分離區域和檢測區域兩個部分組成。