[發明專利]一種抗人組織因子單鏈抗體及其制備方法

有效

• 申請號: 201310181618.8
• 申請日: 2013-05-16
• 公開（公告）號: CN103342752A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 何永吉;趙邑;趙峰梅;張全愛;梁雅麗;潘薇薇;趙亞蕊;曹鵬程;盧曉霞
• 申請（專利權）人: 太原博奧特生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N15/13;C12N15/70
• 代理公司: 太原晉科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 鄭晉周

技術領域

本發明屬于基因工程抗體領域，具體涉及一種抗人組織因子單鏈抗體的制備及其應用。

背景技術

組織因子(tissue?factor,?TF)為一個跨膜糖蛋白，是引起凝血反應的起始蛋白質，能激活和啟動外源凝血途徑，在生理性止血中起著重要作用。近年來的研究發現，組織因子不僅在凝血途徑中起著重要作用，在各種惡性腫瘤中也常常異常表達。臨床研究表明，多種腫瘤細胞都不同程度地過度表達TF，且TF的表達與腫瘤細胞的轉移能力呈高度正相關。TF通過形成TF/VIIa復合物，激活或上調細胞因子IL-8?、CCN1、VEGF?等的表達從而影響腫瘤的侵襲和轉移。因此，研究阻斷或調節TF活性的途徑，特異性地抑制病態組織中的TF，是當前該領域研究的熱點。

單克隆抗體具有高效、低毒和靶向性強的特點，在惡性腫瘤的治療中越來越受到人們的關注。以組織因子作為新的靶蛋白，利用組織因子抗體的靶向性和抗原抗體的特異性，抑制TF活性，阻斷細胞信號傳導途徑，從而減弱腫瘤細胞的生長和轉移，是目前探索治療腫瘤的重要策略之一。已有文獻報道，組織因子鼠源性單克隆抗體經動物實驗證明，對黑色素瘤、肺癌等有較好的療效，特別是對造血系統腫瘤如白血病、非霍奇金淋巴瘤等療效更好。Huang(Science,1997,?275(5229):547-550.)和Versteeg?(Mol?Med,2004,10(16):6.)等的動物模型研究也證明：TF抗體與TF結合后，可以靶向性抑制腫瘤血管的生成，導致腫瘤壞死。但鼠源單克隆抗體具有較強的免疫原性，容易產生人抗鼠抗體（HAMA）放應而降低療效；而人源性抗體制備尚存在許多技術障礙，為其臨床應用帶來了困難。單鏈抗體（single?chain?variable?fragment,?scFv）是將抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL通過連接肽（Linker）重組而成的一種小分子基因工程抗體，它在保持原有抗體良好的抗原結合能力的同時，具有分子量低，穿透力強，體內循環半衰期短以及免疫原性低等優勢，可通過特異性結合腫瘤表面的TF應用于癌癥治療。同時單鏈抗體還可與其他效應分子構建成多種具有新功能的抗體分子，是構建免疫毒素和雙特異性抗體的基礎元件。

發明內容

本發明目的是克服上述已有技術的不足，提供一種分子量小、對腫瘤組織穿透力強、免疫原性低的抗人組織因子（TF）單鏈抗體（scFv）及其制備方法。

本發明是采用逆轉錄聚合酶鏈式反應技術，從中國專利CN?200910227865.0中制備的抗組織因子雜交瘤細胞株出發，擴增獲得抗體的輕鏈可變區基因VL和重鏈可變區基因VH，然后用一段連接序列Linker連接而成的單鏈抗體，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1。

所述的單鏈抗體基因含有354個核苷酸組成的重鏈可變區基因VH，其序列為SEQ?ID?NO:2。所述的抗體重鏈可變區基因VH編碼?118個氨基酸，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:4。

所述的單鏈抗體基因含有321個核苷酸組成的輕鏈可變區基因VL，其序列為SEQ?ID?NO:3。所述的抗體輕鏈可變區基因VL編碼?107個氨基酸，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:5。

本發明抗人組織因子單鏈抗體的制備方法，其步驟如下：

（1）抗人組織因子單鏈抗體的基因克隆

利用CN200910227865.0制備的抗人組織因子單克隆抗體雜交瘤細胞株，TRIZOLLS試劑提取細胞總RNA。RT-PCR方法分別以VL-F/VL-R和VH-F/VH-R擴增鼠源抗人組織因子單抗的輕、重鏈可變區基因片段VL和VH；合成雙鏈Linker，對應的編碼核苷酸序列為：GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG。以上步獲得的VH、VL?和雙鏈Linker為模板，VH-F、VL-R為引物，擴增VH-Linker-VL?基因片段，并進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定；

PCR擴增引物序列如下：?????

VH-F：?GCCATGGCCATGGAGATCCAGCTGCAGCAGTCTG（含NcoI和保護堿基）?

VH-R：?TGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACTGTGAGAG

VL-F：?GGCGGTGGCGGATCGGACATTCAGATGACCCA

VL-R：?GGATCCTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAG（含BamHI）