[發明專利]一種抗人組織因子單鏈抗體及其制備方法

有效

• 申請號: 201310181618.8
• 申請日: 2013-05-16
• 公開（公告）號: CN103342752A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 何永吉;趙邑;趙峰梅;張全愛;梁雅麗;潘薇薇;趙亞蕊;曹鵬程;盧曉霞
• 申請（專利權）人: 太原博奧特生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N15/13;C12N15/70
• 代理公司: 太原晉科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 鄭晉周

1.一種抗人組織因子單鏈抗體，其特征是采用逆轉錄聚合酶鏈式反應技術，從中國專利CN?200910227865.0中制備的抗組織因子雜交瘤細胞株出發，擴增獲得抗體的輕鏈可變區基因VL和重鏈可變區基因VH，然后用一段連接序列Linker連接而成的單鏈抗體，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1。

2.如權利要求1所述的抗人組織因子單鏈抗體，其特征是所述的單鏈抗體基因含有354個核苷酸組成的重鏈可變區基因VH，其序列為SEQ?ID?NO:2。

3.如權利要求1所述的抗人組織因子單鏈抗體，其特征是所述的單鏈抗體基因含有321個核苷酸組成的輕鏈可變區基因VL，其序列為SEQ?ID?NO:3。

4.如權利要求1或2所述的抗人組織因子單鏈抗體，其特征是所述的抗體重鏈可變區基因VH編碼?118個氨基酸，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:4。

5.如權利要求1或3所述的抗人組織因子單鏈抗體，其特征是所述的抗體輕鏈可變區基因VL編碼?107個氨基酸，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:5。

6.如權利要求1所述一種抗人組織因子單鏈抗體，其特征是所述的單鏈抗體與TF₂₄₃保持高特異性結合，作為一種腫瘤治療的抗體物質。

7.如權利要求1所述抗人組織因子單鏈抗體的制備方法，其特征是：

（1）抗人組織因子單鏈抗體的基因克隆

利用CN200910227865.0制備的抗人組織因子單克隆抗體雜交瘤細胞株，TRIZOLLS試劑提取細胞總RNA；RT-PCR方法分別以VL-F/VL-R和VH-F/VH-R擴增鼠源抗人組織因子單抗的輕鏈可變區VL、重鏈可變區VH基因片段；合成雙鏈Llinker，對應的編碼核苷酸序列為：GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG；以上步獲得的VH、VL?和雙鏈Linker為模板，VH-F、VL-R為引物，擴增VH-Linker-VL?基因片段，并進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定；

PCR擴增引物序列如下：?????

VH-F：?GCCATGGCCATGGAGATCCAGCTGCAGCAGTCTG（含NcoI和保護堿基）?

VH-R：?TGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACTGTGAGAG

VL-F：?GGCGGTGGCGGATCGGACATTCAGATGACCCA

VL-R：?GGATCCTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAG（含BamHI）

Linker-F：CTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGC

GGTGGCGGATCG

Linker-R：TGGGTCATCTGAATGTCCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGA

ACCGCCTCCACC

（2）抗人組織因子單鏈抗體原核可溶表達載體的構建

選擇phoA-6his質粒（由山西省生物研究所保存）作為表達載體，該質粒通過堿性磷酸酶啟動子及信號序列將外源蛋白表達至細胞周質間；NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切phoA-6his質粒和VH-Linker-VL?PCR產物用后，連接，轉化至E.coli?DH5α，氨芐青霉素篩選陽性克隆，酶切鑒定，測序分析；

（3）抗人組織因子單鏈抗體在MM294細菌中表達及純化?

重組表達載體轉化MM294大腸桿菌，LB培養基搖菌后稀釋菌至低磷酸鹽（0.1mmol/L）誘導培養基中培養；培養24?h后，離心收集菌體；菌體與蛋白提取緩沖液按1：5比例混勻，高壓勻漿破碎，低溫高速離心，收集上清；采用Ni?sepharose^TM?6?Fast?Flow親和層析純化；純化樣經SDS-PAGE凝膠電泳分析；?

（4）抗人組織因子單鏈抗體的活性鑒定

以中國專利CN200510012414.7制備的截斷型人重組組織因子TF₂₄₃為抗原，利用非競爭ELISA法測定抗組織因子單鏈抗體蛋白與TF₂₄₃的結合特異性：選取96孔酶標板，?pH9.6碳酸鹽緩沖液包被TF₂₄₃，4℃保存過夜后明膠封閉；甩干后依次加入單鏈抗體蛋白、HRP酶標二抗、鄰苯二胺(OPD)，492?nm處酶標儀測定。