[發明專利]納豆激酶高產枯草芽孢桿菌株的篩選及液態發酵的方法

在審

• 申請號: 201310178561.6
• 申請日: 2013-05-15
• 公開（公告）號: CN104152429A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 戴東升;王星星;楊仁佳;安俊;鄭慧;周鵬;姚振芳;王斐;陳婧;禹玉洪;任武賢
• 申請（專利權）人: 亞寶藥業集團股份有限公司
• 主分類號: C12N9/56
• 分類號: C12N9/56;C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及生物技術領域中一種納豆激酶高產枯草芽孢桿菌株篩選及液態發酵的方法。?

背景技術

今后30年，我國老年人口將越來越多，老年人的身體健康問題越來越受到人們的關注和重視。心腦血管栓塞性疾病是危害老年人健康最嚴重而又常見的疾病之一。目前，血栓癥已逐漸成為死亡率最高的疾病之一，而溶解血栓是治療這一類疾病的一種重要手段。因此，對溶栓藥物的研究已被廣為重視。當前作為第一代溶栓藥物鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)在臨床上廣為應用，但它們均為激活人體內血液中血纖維酶原，從而降解纖維蛋白，容易引起全身性纖溶激活并伴有出血傾向。同時SK還具有抗原性并有過敏性反應。而作為第二代纖溶藥物的t-PA盡管對纖維蛋白有很高的選擇性，但臨床上為了取得較好的溶栓效果而應用大劑量(100mg)從而部分失去了對纖維蛋白的選擇性，因此依舊會導致出血等副作用，并且具有纖維蛋白特異性差、體內半衰期短、生產成本高、需大劑量連續用藥等缺點。鑒于此，開發新型溶栓藥物已成為重要的研究熱點之一。目前，納豆激酶(NK)作為來自于食品、高效安全并可直接由消化道吸收、起到溶解纖維蛋白作用的纖溶酶，具有安全性好，體內作用時間長，藥效時間長等優點。正在成為當今溶栓藥研究的焦點。?

當今影響納豆激酶產業化的最主要原因是，生產成本高，生產周期長。因此篩選出一株高產納豆激酶的菌株，以及建立一種合適的發酵工藝，對納豆激酶的產業化具有重要意義。?

發明內容

本發明提供一種用于納豆激酶液態發酵的發酵培養基，其包括：大豆蛋白胨，可溶性淀粉，Na₂HPO₄·12H₂O，KH₂PO₄，CaCl₂，MgSO₄·7H₂O。?

根據本發明，所述發酵培養基包括：大豆蛋白胨1.0-2.5％，可溶性淀粉2.0-4％，Na₂HPO₄·12H₂O0.4-0.5％，KH₂PO₄0.15-0.25％，CaCl₂0.01-0.03％，MgSO₄·7H₂O0.05-007％。?

本發明還提供一種納豆激酶液態發酵的方法，其特征在于，所述方法包括以下步聚：?

(1)取保存于固體培養基上的菌種(優選半環)，接種在種子培養基中(pH優選為6.8-7.2)，?

(2)恒溫培養(優選10-14小時)，之后接種到所述發酵培養基中進行發酵。?

根據本發明，步驟(1)在已消毒的超凈工作臺上進行。?

根據本發明，其中接種到發酵培養基中的接種量為2-10％，優選2-4％。?

根據本發明，步驟(1)所述接種在種子培養基中的操作條件：優選的溫度為34-37℃，優選的轉速為160-300rpm。?

根據本發明，步驟(2)中的發酵為液態發酵，優選上述液態發酵可以在搖瓶中發酵，也可以在發酵罐中發酵，例如5L的發酵罐。?

根據本發明，在搖瓶中發酵，培養基pH優選為6.9-7.1，溫度優選33-18℃，160rpm恒溫培養48-54小時。?

根據本發明，在發酵罐中發酵，采取隨著發酵罐的溶解氧(DO)的變化而提高發酵罐攪拌子的轉速，即隨著發酵時間的延長而調大攪拌速度，優選攪拌速度從300rpm提高到700rpm，更優選從320rpm提高到700rpm。?

根據本發明，在發酵罐中發酵，發酵罐裝液量為50-70％，接種量為2-4％，通氣量為0.5-0.8vvm，培養pH為6.9-7.1(以氨水和乙酸調節pH)，溫度為35-37℃，整個發酵周期為28-32小時。?

根據本發明，所述種子培養基為營養肉湯培養基，包括蛋白胨1.0％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，pH值7.0，或者在其中加入一些緩沖液成份。?

本發明還提供一種高產納豆激酶的芽孢枯草桿菌株YBNK-1，經廣東省微生物分析檢測中心鑒定為枯草芽孢桿菌，檢測報告編號為粵微檢2012ZD0175。?

上述菌株經中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期：2013年04月12日，保藏號為CGMCC?NO.7467，確定為枯草芽孢桿菌，Bacillus?subtilis。?