[發明專利]一種利用正常人多種皮膚細胞篩查皮膚抗氧化劑安全和功效的方法

有效

• 申請號: 201310176059.1
• 申請日: 2013-05-13
• 公開（公告）號: CN103320490A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 程樹軍;秦瑤;步犁;談偉君
• 申請（專利權）人: 程樹軍;廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 周克佑

1.一種利用正常人多種皮膚細胞篩查皮膚抗氧化劑安全和功效的方法，其特征是含以下步驟：

(1)正常人原代細胞的分離、培養和鑒定以離體包皮為原料，經分離、培養和鑒定，獲得正常人皮膚原代細胞；

(2)受試物的毒性檢驗將受試物配置一組具有濃度梯度的溶液，當正常人皮膚原代細胞的細胞密度長至80%～90%時，在多個正常人皮膚原代細胞中分別加入上述具有濃度梯度的受試物形成受試物組，同時設立陽性對照組、陰性對照組和空白對照組，在各組中分別加入MTT和DMSO溶液，用酶標法分別測各組的吸光度，并根據下述公式，計算細胞活性抑制率，細胞活性抑制率=[1－(受試物吸光度值－空白吸光度值)÷（陰性對照吸光度值－空白吸光度值）]×100%，根據細胞活性抑制率曲線，計算出皮膚抗氧化劑的20%抑制濃度（IC₂₀）、半數致死抑制濃度（IC₅₀）、70%抑制濃度（IC₇₀），抗氧化劑的毒性判斷過程如下：

（一）經口毒性預測：根據下述公式預測急性經口毒性試驗的LD₅₀，log(LD₅₀[mmol/kg])=0.435×log(IC₅₀[mmol/L])+0.625，如LD₅₀＞5000mg/kg，預測該受試物實際無毒，可用于食品、藥品抗氧化的進一步研究，如LD₅₀＜500mg/kg，預測該受試物中等毒性，不適宜進一步開發，如500mg/kg＜LD₅₀且＜5000mg/kg，預測該受試物可能微毒性，建議在該受試物的安全劑量范圍內進行下一步研究；

（二）細胞毒性判定：選擇受試物的可溶解最大濃度測試，如細胞活性抑制率IC＜30%時，表明在此濃度下該受試物可認為無細胞毒性，該受試物可用于皮膚抗氧化劑功效的進一步測試；

(3)受試物的配制及受試物濃度的確定將受試物配制一組具有濃度梯度的溶液；當正常人原代細胞的細胞密度長至80%時，將該組具有濃度梯度的受試物，分別加入多個正常人原代細胞中形成受試物組，并分別設置陽性對照、空白對照以及陰性對照，按照MTT法，測試細胞的活性，用酶標法測試各組的吸光度，按照公式：細胞活性=（受試物吸光度值—空白對照吸光度值）/（陰性對照吸光度值—空白對照吸光度值），皮膚抗氧化功效的研究需要在外界因素造成皮膚細胞氧化損傷后的情況下進行，其中外界因素包括紫外線照射或化學試劑損傷，應選取細胞活性＞90%的受試物濃度為最高試驗濃度；

(4)紫外線誘導輻射劑量的確定

正常人原代細胞的細胞密度長至80%時，設置具有梯度的UVA及UVB輻照量，按具有梯度的UVA及UVB輻照量分別照射多個正常人原代細胞形成正常人原代細胞組，并設置空白對照和陰性對照，利用酶標儀分別測試正常人原代細胞組、空白對照以及陰性對照的吸光度，根據公式：細胞活性=（紫外線照射正常人原代細胞組吸光度值—空白對照吸光度值）/（陰性對照吸光度值—空白對照吸光度值），選取細胞活性在70%的輻照劑量進行抗氧化效果試驗；

(5)受試物抗氧化效果的確認根據步驟(3)確定的受試物濃度和步驟(4)中確定的UVA及UVB輻照劑量，待正常人原代細胞長至80%時，分別設立未輻照組、輻照后加受試物組以及輻照后不加受試物組，以正常人原代皮膚細胞經紫外線照射后添加維生素C為陽性對照，測試各組的細胞凋亡、細胞周期、ROS水平以及SOD水平，并根據測試結果，判斷各皮膚抗氧化劑的抗氧化效果。

2.根據權利要求1中所述的利用正常人多種皮膚細胞篩查皮膚抗氧化劑安全和功效的方法，其特征是：步驟(1)中所述的正常人皮膚原代細胞為正常人原代角質細胞、正常人原代人成纖維細胞、正常人黑色素細胞和正常人表皮干細胞中的一種或幾種。

3.根據權利要求1中所述的利用正常人多種皮膚細胞篩查皮膚抗氧化劑安全和功效的方法，其特征是：步驟(2)中所述的受試物為皮膚疑似抗氧化劑。

4.根據權利要求3中所述的利用正常人多種皮膚細胞篩查皮膚抗氧化劑安全和功效的方法，其特征是：所述皮膚疑似抗氧化劑為維生素C、維生素E、原花青素、白藜蘆醇、紅石榴提取物、槲皮素提取物、淡竹葉提取物、虎杖提取物、何首烏提取物、淫羊藿提取物、姜黃素、丹參酮、2,6-二氯-3-硝基吡啶胺、阿魏酰哌啶類化合物、二羥基苯甲酰腙銅、曲酸、熊果苷、多元醇類、透明質酸或神經酰胺。