[發(fā)明專利]一種致敏動物的脾細胞模型及其在藥物篩選中的用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310174624.0
• 申請日: 2013-05-13
• 公開（公告）號: CN104152397A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設計）人: 力弘;李雯;歐穎曄;章蘊毅;陳道峰
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發(fā)明屬于藥學藥物篩選領域，涉及細胞模型及其用途，具體涉及一種致敏動物的脾細胞模型及其在藥物篩選中的用途；所述模型可用于建立離體藥物篩選，尤其作為篩選防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）藥物的高通量篩選平臺。

背景技術

已知系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種難治的、反復發(fā)作、致死率高的嚴重自身免疫病；雖然所述SLE?的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，但患者均存在免疫調節(jié)功能嚴重失調，機體高水平的抗自身抗體和低水平的單核巨噬細胞清除能力，使免疫復合物增多，并廣泛性激活補體系統(tǒng)，造成機體的炎癥擴大和組織器官損傷，同時使機體對自身抗原的識別長期存在，造成病情的遷延不愈。

有研究報道，針對SLE?患者能檢測到多種自身抗體的產生，如抗核抗體，抗雙鏈DNA?抗體（抗dsDNA抗體），抗組蛋白抗體等；且由于其免疫調節(jié)障礙，能引起丙種球蛋白升高，以及相關細胞因子分泌的改變，如干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-10（IL-10）和白細胞介素-17?（IL-17）等的水平升高。

目前，國內外抗SLE?藥物研究中采用的動物模型有自發(fā)性的SLE?模型（如MRL/lpr）和空腸彎曲菌誘導的實驗性模型等，上述模型證實了環(huán)境因素對免疫耐受的維持和遺傳因素起著同樣至關重要的作用；但其中所述動物模型的實驗周期長，不能實現(xiàn)藥物高通量篩選；由于空腸彎曲菌CJ-S131的43KD的熱休克蛋白和LPS?均具有與機體自身抗原相似的抗原表位（分子模擬現(xiàn)象），細菌成分作為交叉抗原進入體內，產生應激，引起一系列免疫反應，T細胞活化后通過旁路途徑輔助B?細胞多克隆激活，引起自身抗體的產生，使得空腸彎曲菌可誘導小鼠形成具有典型的SLE?樣癥狀，該模型為目前研究SLE?病理機制及尋找治療藥物較理想的模型之一。

柴胡是我國的傳統(tǒng)中藥和常用中藥，其性味苦涼，有疏散退熱、疏肝解郁、升陽舉氣之功效，用于治療寒熱往來，胸滿脅痛，口苦耳聾，頭痛目眩等。以柴胡為主藥的小柴胡湯性較平和，具有和解少陽之功，以清泄樞機之熱為特點，有報道用于熱毒熾盛型SLE，療效顯著；已有文獻（ZhengWang,?Hong?Li,?et?al.?Beneficial?effect?of?Bupleurum?polysaccharides?on?autoimmune?disease?induced?by?Campylobacter?jejuni?in?BALB/c?mice.?Journal?of?Ethnopharmacology.?2009;?124:?481-487.）報道，柴胡多糖對SLE?樣小鼠具有保護作用，能選擇性抑制補體激活，并對小鼠免疫功能具有調節(jié)作用。鑒于目前國內外均缺乏離體高通量篩選制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）藥物的方法，本申請的發(fā)明人擬提供一種致敏動物的脾細胞模型，并采用所述柴胡多糖驗證該脾細胞模型在離體高通量篩藥方面的特性，進一步建立離體高通量篩選制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）藥物的方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種致敏動物的脾細胞模型及其在藥物篩選中的用途。該致敏動物的脾細胞模型實驗周期短、能實現(xiàn)藥物高通量篩選。

本發(fā)明的致敏動物的脾細胞模型通過下述方法制備，采用空腸彎曲菌CJ-S131誘導建立小鼠SLE樣模型，取模型鼠脾臟細胞，用CJ-S131離體刺激，制得SLE樣表現(xiàn)的離體模型；該離體模型表現(xiàn)出SLE相關免疫指標升高，所述SLE相關免疫指標包括：抗dsDNA抗體、總IgG、IFN-γ和IL-10。

更具體的，本發(fā)明的致敏動物的脾細胞模型的制備方法，其特征在于，其包括步驟：

采用空腸彎曲菌CJ-S131誘導小鼠產生SLE樣癥狀，按常規(guī)方法處理實驗小鼠，無菌條件下取其脾臟，制備單細胞懸液；在培養(yǎng)板中加入空腸彎曲菌CJ-S131，再次刺激已致敏的脾細胞，制得致敏動物的脾細胞模型。

本發(fā)明進一步采用具有抗SLE作用的藥物柴胡多糖，驗證上述離體模型在藥物篩選中的用途，尤其是在制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的用途。

本發(fā)明中，在制得的脾細胞模型中加入不同濃度的待測藥物柴胡多糖，置于37℃、5%?CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h；培養(yǎng)結束后，吸取培養(yǎng)板中的細胞培養(yǎng)上清，檢測抗dsDNA抗體、總IgG、IFN-γ和IL-10等疾病相關免疫學指標，結果顯示，SLE相關病變指標中，細胞培養(yǎng)上清液中抗dsDNA抗體、總IgG、相關炎癥因子IFN-γ和IL-10水平明顯升高；

結果表明，采用本發(fā)明制得的脾細胞模型可用于篩選防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的藥物。