[發(fā)明專利]一種致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型及其在藥物篩選中的用途

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310174624.0
• 申請(qǐng)日: 2013-05-13
• 公開（公告）號(hào): CN104152397A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 力弘;李雯;歐穎曄;章蘊(yùn)毅;陳道峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.一種致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型，其特征在于，所述的致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型通過采用空腸彎曲菌CJ-S131誘導(dǎo)建立小鼠SLE樣模型，取模型鼠脾臟細(xì)胞，用CJ-S131離體刺激，制得SLE樣表現(xiàn)的離體模型；該離體模型表現(xiàn)出SLE相關(guān)免疫指標(biāo)升高，所述SLE相關(guān)免疫指標(biāo)包括：抗dsDNA抗體、總IgG、IFN-γ和IL-10。

2.權(quán)利要求1所述的致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型的制備方法，其特征在于，其包括步驟：

采用空腸彎曲菌CJ-S131誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生SLE樣癥狀，按常規(guī)方法處理實(shí)驗(yàn)小鼠，無菌條件下，制備其脾臟單細(xì)胞懸液；在培養(yǎng)板中加入空腸彎曲菌CJ-S131，再次刺激已致敏的脾細(xì)胞，制得致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型。

3.權(quán)利要求1所述的致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型在篩選防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的用途。

4.按權(quán)利要求3所述用途，其特征在于，所述篩選方法包括步驟：

（1）建立SLE相關(guān)免疫異常細(xì)胞模型：

采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：正常對(duì)照鼠、佐劑對(duì)照鼠、CJ-S131誘導(dǎo)的SLE樣模型小鼠；常規(guī)方法處理實(shí)驗(yàn)小鼠，無菌操作將獲得的實(shí)驗(yàn)小鼠脾臟放入盛有預(yù)冷的1640培養(yǎng)液的表面皿中，制得脾單細(xì)胞懸液并調(diào)節(jié)脾細(xì)胞濃度，取細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入CJ-S131和脾細(xì)胞懸液，加板后，混勻，置于37℃、5%?CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h；培養(yǎng)結(jié)束后，離心，吸取每孔的細(xì)胞上清液，分裝，放入-80℃冰箱保存，備用；

（2）采用SLE樣細(xì)胞模型篩選藥物

采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：?CJ-S131誘導(dǎo)的SLE樣模型小鼠；常規(guī)方法處理實(shí)驗(yàn)小鼠，無菌操作將獲得的實(shí)驗(yàn)小鼠脾臟放入盛有預(yù)冷的1640培養(yǎng)液的表面皿中，制得脾單細(xì)胞懸液并調(diào)節(jié)脾細(xì)胞濃度，取細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入待測(cè)藥物，CJ-S131和脾細(xì)胞懸液，加板后，混勻，置于37℃、5%?CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，離心，吸取每孔的細(xì)胞上清液，分裝后放入-80℃冰箱保存，檢測(cè)抗dsDNA抗體、IgG、IFN-γ和IL-10指標(biāo)；????

（3）抗dsDNA抗體測(cè)定：

50μg/ml?dsDNA包被酶標(biāo)板，?4℃過夜；?PBS-1%BSA封閉，100μl/孔，37℃?孵育2h；PBS-T洗滌，加待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清原液，100ul/孔，35C孵育2h；加1:1000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP，37℃孵育2h；加1/1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體，?37℃?孵育1h；加入OPD底物溶液，37℃避光孵育20min；加入2M?H₂SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀492nm測(cè)定OD；

（4）總IgG測(cè)定：

10μg/ml?羊抗小鼠IgG包被酶標(biāo)板，?4℃過夜；配制純小鼠IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線；取出酶標(biāo)板，傾去其上清，?PBS-1%BSA封閉，100μl/孔，37℃?孵育2h；分別加入各濃度的純小鼠IgG或待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清原液，100μl/孔，35C孵育2h，?PBS-T洗滌5次，250μl/孔；加1:1000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP，100ul/孔，37℃孵育2h；PBS-T洗滌5次，300μl/孔；加1:5000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP酶標(biāo)抗體，100μl/孔，37℃?孵育2h；PBS-T洗滌4次，300μl/孔；加入OPD底物溶液，100μl/孔，37℃避光孵育20min；加入2M?H₂SO₄終止反應(yīng)，50μl/孔，酶標(biāo)儀492nm測(cè)定OD；

（5）測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ；

（6）測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-10；篩選得到防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物。