[發明專利]一種抗CD20單克隆抗體-海兔毒素偶聯物及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310170344.2
• 申請日: 2013-05-08
• 公開（公告）號: CN103254317A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 陳樞青;李朝輝;張騫;徐曉倩
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/107;A61K38/07;A61K47/48;A61P35/00
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 馬士林

技術領域

本發明屬于生物技術和藥物領域，具體涉及一種抗CD20單克隆抗體-海兔毒素偶聯物及其制備方法和應用。

背景技術

CD20是B淋巴細胞和B淋巴瘤細胞表面特有的膜表面蛋白，在造血干細胞、原始B細胞、正常血漿細胞以及其它正常組織不表達（Bubien?J?K等，J?Cell?Biol，1993，121(5):1121-1132）。因此研制抗CD20抗原的單克隆抗體就可以專一性地殺傷B細胞和B淋巴瘤細胞，達到良好的治療效果。

Ofatumumab（簡稱OFA）是全人源化靶向抗CD20單克隆抗體，2009年被FDA批準用于氟達拉濱和阿侖珠單抗治療無效的頑固性慢性淋巴細胞白血病（CLL）（CASTILLO?J．Expert?Opin?Investing?Drμgs，2009，18(4):491-500.）。OFA單抗通過與小型和大型的CD20分子上的小環抗原靶向結合，促使細胞溶解，特異性地誘導CD20陽性細胞凋亡，從而專一性地殺滅B淋巴瘤細胞（BEUM?P?V，Immuuol，2008，181(1):822-832.），而對其他正常組織無不良影響。

但是同時，由于OFA單抗本身的局限性，使得其殺傷CD20陽性B淋巴瘤細胞的能力非常有限，經過一段時間的治療沒有殺盡的腫瘤細胞又會重新生長并對OFA單抗產生耐藥性。因此，OFA單抗殺死腫瘤細胞的能力亟需提高，而通過抗體偶聯毒性小分子便能達到此效果。

抗體偶聯小分子，即為抗體偶聯藥物，由單抗與“彈頭”藥物兩部分構成。作為“彈頭”的抗腫瘤藥物主要通過抑制細胞DNA或蛋白質合成、抑制細胞、有絲分裂等方式來殺傷腫瘤細胞。但這些藥物對正常的細胞同樣有較大殺傷力，從而極大的限制了該類藥物的進一步應用和發展。例如化療藥物海兔毒素（Monomethyl?auristatin?E，MMAE）是一種人工合成抗腫瘤小分子，它通過抑制細胞內微管蛋白二聚化而誘導細胞凋亡。但由于它具有很強的無選擇毒性，會對正常細胞造成傷害，所以其本身并不能成藥。

單抗是藥物良好的靶向性載體，利用藥物分子上特殊的功能基團如：羥基、巰基、氨基等可將藥物與單抗相連接而組成化學免疫偶聯物，單抗的靶向性能將與之相連的藥物“精確”地運送到靶細胞，有效地提高了腫瘤局部的藥物濃度，極大地降低體內其他組織、器官的藥物濃度，從而達到增效減毒的作用。

申請號為201310046396.9的中國專利文獻公開了一種抗CD20抗體-海兔毒素偶聯物的制備方法，將OFA單抗重鏈恒定區第123位的丙氨酸突變為半胱氨酸，以獲得OFA單抗與海兔毒素的偶聯位點。

由于該制備方法需要對OFA單抗進行定點突變，操作步驟繁瑣，并且突變后獲得的抗CD20抗體只能偶聯1～2個海兔毒素分子，對腫瘤細胞的殺傷力還有待提高。

發明內容

本發明提供了一種抗CD20單克隆抗體-海兔毒素偶聯物的制備方法，利用該制備方法獲得的抗CD20單克隆抗體-海兔毒素偶聯物對CD20陽性細胞具有更高的殺傷力。

一種抗CD20單克隆抗體-海兔毒素偶聯物的制備方法，包括：

（1）將抗CD20單克隆抗體溶于緩沖液中，加入三氯乙基磷酸酯，進行還原反應；

所述抗CD20單克隆抗體優選為Ofatumumab單抗。Ofatumumab單抗能夠特異結合CD20分子，從而專一地殺傷B淋巴瘤細胞，而對其他正常組織無不良影響。

由于抗CD20單克隆抗體表面的半胱氨酸巰基均用于形成重鏈-重鏈、重鏈-輕鏈之間的二硫鍵，因而不存在游離的半胱氨酸巰基用于與海兔毒素偶聯；因此在與海兔毒素偶聯之前，需使抗CD20單克隆抗體形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸巰基處于游離狀態。

三氯乙基磷酸酯可使抗CD20單克隆抗體鏈間二硫鍵斷開，優選地，所述緩沖液為pH7.4的PBS緩沖液；三氯乙基磷酸酯與抗CD20單克隆抗體的摩爾比為5.5～10:1；所述還原反應的條件優選為：25～37℃水浴反應1～3h。

（2）將被還原的抗CD20單克隆抗體與帶連接臂的海兔毒素混合，進行偶聯反應；