[發明專利]一種多靶點基因檢測甲型H1N1流感病毒變異株的方法和試劑盒

無效

• 申請號: 201310169249.0
• 申請日: 2013-05-07
• 公開（公告）號: CN103215387A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 沈潔;厲力華;徐銘恩
• 申請（專利權）人: 杭州電子科技大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 徐飛虎;徐關壽

技術領域

本發明涉及病毒檢驗檢測領域，具體涉及針對M基因和HA基因檢測甲型H1N1流感病毒變異株的多靶點檢測用引物、相應的試劑盒及檢測方法。

背景技術

甲型H1N1流感于2009年4月由墨西哥開始，造成了全球大流行的疫情。序列進化分析顯示，該病毒為一個新型甲型流感變異株，與人類季節性H1N1流感病毒和經典H1N1豬流感病毒，存在明顯差異。序列分析顯示它的8個基因片段具有明顯特殊性。但其HA片段與北美豬流感病毒HA片段同源性最高，為95％左右；NA和M與歐亞豬源病毒片段最為相近，同源性分別為92％和97％。因此在實際的診斷與檢測中，采用核酸擴增方法進行鑒別時，必須進行仔細的序列比對分析，才能確保診斷與檢測的準確性。

由于PCR檢測技術以其靈敏性、特異性、高效性而最為通用，在甲型H1N1流感暴發后國內外很多學者研究建立了熒光RT-PCR檢測方法用于檢測甲型H1N1流感病毒(2009變異株)流感病毒。但是，熒光RT-PCR檢測方法也存在檢測中發生假陰性或假陽性的可能。

發明內容

針對現有技術不足，本發明提供了一種可靠的多基因靶點檢測甲型H1N1流感病毒變異株的方法和試劑盒。

本發明的原理是針對M和HA基因多個基因靶點檢測甲型H1N1流感病毒2009變異株，用毛細管電泳熒光探測顯示序列片段大小，來直觀地確定擴增的每個片段的準確性。為避免人類樣品在采集，保存和運輸中發生降解人類而引起假陰性結果，試劑盒中針對人類beta-2-microglobulin基因設計了引物。同時，多基因靶點層層確認陽性結果，確保了檢測結果的特異性。另外。本試劑盒可以檢測出非H1N1甲型流感感染，和非甲型流感感染樣品，提供了進一步診斷的信息。

針對M基因和HA基因，發明人設計和建立了可靠的多基因靶點檢測方法。通過仔細的序列比對分析，設計了引物針對以下基因靶點：

M基因片段–檢測所有甲型流感

HA基因片段1-特異性針對甲型H1N1流感病毒(2009變異株)

HA基因片段2-檢測所有H1N1的流感病毒

人類beta-2-microglobulin基因片段–檢測樣品中人體組織

感染甲型H1N1流感病毒(2009變異株)的病人樣品，必須能擴增出以上多個片段，并在毛細管電泳中顯示正確的序列片段大小。這種檢測方法保證了檢測結果的特異性，并且使用者能直觀地通過擴增的片段大小來查看和確認檢測結果。

因此，本發明的第一個目的是提供特異性強、靈敏度高的針對M和HA基因檢測甲型H1N1流感病毒2009變異株的包含多組引物序列的檢測試劑盒。

發明人選擇甲型H1N1流感病毒(2009變異株)的M和HA基因核苷酸序列與其他A型流感病毒M和HA基因編碼區特定序列作為靶區域，在多重序列比對的基礎上進行引物設計。引物長度為20個堿基左右，GC含量為50％-60％，引物內無二級結構和重復性，引物間和引物內無互補序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5℃。通過優化選擇，最終獲得包含如下多組引物的試劑盒：

一組針對M基因檢測所有甲型流感病毒的引物，其序列如下所示：

1)5’-GAA?TGG?CTA?AAG?ACA?AGA?CC-3′(SEQ?ID?NO：1)

2)5’-GCT?GCA?GTC?CTC?GCT?CAC?T-3’(SEQ?ID?NO：2)

其中序列1)和2)分別為檢測所有甲型流感病毒M基因的正義引物和反義引物,反義引物的5’端標記報告熒光基團FAM(6-carboxy-熒光素)；

一組針對HA基因檢測所有H1N1的流感的引物，其序列如下所示：

3)5’-GCA?GAT?CAA?AAG?AGC?ACA?CAA?AAT-3′(SEQ?ID?NO：3)

4)5’-CCA?AAG?TTC?TTT?CAT?TTT?CCA?AT-3’(SEQ?ID?NO：4)

其中序列3)和4)分別為檢測所有H1N1流感病毒HA基因的正義引物和反義引物,反義引物的5’端標記報告熒光基團FAM(6-carboxy-熒光素)；

一組針對HA基因檢測甲型H1N1流感病毒2009變異株的引物序列，其序列如下所示：

5)5’-CAT?TCG?CAA?TGG?AAA?GAA?A-3′(SEQ?ID?NO：5)

6)5’-TCC?TCA?ATC?CTG?TGG?CCA?G-3’(SEQ?ID?NO：6)