[發(fā)明專利]一種多靶點(diǎn)基因檢測甲型H1N1流感病毒變異株的方法和試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310169249.0
• 申請日: 2013-05-07
• 公開（公告）號: CN103215387A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈潔;厲力華;徐銘恩
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州電子科技大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 徐飛虎;徐關(guān)壽

1.一種用于檢測甲型H1N1流感病毒變異株的試劑盒，該試劑盒含有如下的多組引物：

一組針對M基因檢測所有甲型流感病毒的引物，其序列如下所示：

1)5’-GAA?TGG?CTA?AAG?ACA?AGA?CC-3′(SEQ?ID?NO：1)

2)5’-GCT?GCA?GTC?CTC?GCT?CAC?T-3’(SEQ?ID?NO：2)

其中序列1)和2)分別為檢測所有甲型流感病毒M基因的正義引物和反義引物,反義引物的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM(6-carboxy-熒光素)；

一組針對HA基因檢測所有H1N1的流感的引物，其序列如下所示：

3)5’-GCA?GAT?CAA?AAG?AGC?ACA?CAA?AAT-3′(SEQ?ID?NO：3)

4)5’-CCA?AAG?TTC?TTT?CAT?TTT?CCA?AT-3’(SEQ?ID?NO：4)

其中序列3)和4)分別為檢測所有H1N1流感病毒HA基因的正義引物和反義引物,反義引物的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM(6-carboxy-熒光素)；

一組針對HA基因檢測甲型H1N1流感病毒2009變異株的引物序列，其序列如下所示：

5)5’-CAT?TCG?CAA?TGG?AAA?GAA?A-3′(SEQ?ID?NO：5)

6)5’-TCC?TCA?ATC?CTG?TGG?CCA?G-3’(SEQ?ID?NO：6)

其中序列5)和6)分別為檢測甲型H1N1流感病毒(2009變異株)HA基因的正義引物和反義引物，反義引物的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM(6-carboxy-熒光素)；

一組針對人類beta-2-microglobulin基因檢測樣品中人體組織的引物序列，其序列如下所示：

7)5’-CCA?GCA?GAG?AAT?GGA?AAG?T-3′(SEQ?ID?NO：7)

8)5’-GAT?GCT?GCT?TAC?ATG?TCT?CG-3’(SEQ?ID?NO：8)

其中序列7)和8)分別為檢測人類beta-2-microglobulin基因的正義引物和反義引物，反義引物的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM(6-carboxy-熒光素)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有如下的成分：

（1）、RT-PCR反應(yīng)液，包括1-10×RT緩沖液、SEQ?ID?NO：1、SEQID?NO：3、SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：7正義引物混合、RT-PCR酶和dNTP;

（2）、PCR反應(yīng)液，包括1-10×PCR緩沖液、MgCl₂、SEQ?ID?NO：1-8共8種引物混合、Taq?DNA聚合酶和dNTP；

（3)、純水；

（4)、陰性對照：流感病毒陰性樣品RNA；

（5)、陽性對照：甲型H1N1流感病毒2009變異株陽性樣品RNA。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中，RT-PCR反應(yīng)液中RT緩沖液反應(yīng)終濃度為1X；引物反應(yīng)終濃度為0.05umol/L–0.5umol/L；RT-PCR酶反應(yīng)終濃度為2U-10U（20ul/反應(yīng)）；dNTP反應(yīng)終濃度為0.1mmol/L–0.6mmol/L。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中，10×RT緩沖液組成為750mmol/L?KCl、30mmol/L?MgCl2、50mmol/L?DTT、500mmol/L?Tris-HCl(pH8.3，25℃)。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中，RT-PCR反應(yīng)液中PCR緩沖液反應(yīng)終濃度為1X；MgCl₂反應(yīng)終濃度為1.0mmol/L-3.0mmol/L；引物反應(yīng)終濃度為0.05umol/L–0.5umol/L；PCR酶反應(yīng)終濃度為0.2U-5U（20ul/反應(yīng)）；dNTP反應(yīng)終濃度為0.1mmol/L–0.6mmol/L。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中，10×PCR緩沖液的組成為：500mmol/L?KCl、100mmol/LTris-HCl(pH9.0，25℃)、1.0％Triton?X-100。