[發(fā)明專利]一種檢測綿羊高繁殖力基因BMPR1B的分子診斷方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310168673.3
• 申請日: 2013-05-09
• 公開（公告）號: CN103333948A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙興波;陳曉勇;敦偉濤
• 申請（專利權(quán)）人: 趙興波
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及綿羊高繁殖力基因BMPR1B突變位點A746G的基因型分析方法。本發(fā)明采用等位基因特異PCR（allele?specific?PCR,?AS-PCR）的方法，該方法能夠準(zhǔn)確、快速、簡便地檢測BMPR1B基因突變位點A746G，包括根據(jù)突變位點設(shè)計特異引物和基因型的分析方法。

背景技術(shù)

綿羊繁殖力直接影響?zhàn)B羊生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。綿羊?qū)賳翁ゲ溉轭悇游铮承┚d羊品種卻具有穩(wěn)定的多胎性能，如中國的湖羊、小尾寒羊以及國外的布魯拉美利奴羊(Booroola?Merino)、芬蘭蘭德瑞斯羊（Finnish?Landrace）、羅曼諾夫羊（Romanov?sheep）等品種。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些高效的分子標(biāo)記被應(yīng)用于綿羊多胎性的研究，并產(chǎn)生了許多有效、快速的檢測手段。其中PCR-RFLP、PCR-SSCP、AFLP以及利用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR等技術(shù)在綿羊高繁殖力候選基因的鑒定上得到了廣泛的應(yīng)用。

大量研究證明，BMPR1B基因具有促進(jìn)排卵和增加產(chǎn)羔數(shù)的作用.。在綿羊BMPR1B基因的分子診斷方面，目前通常采用PCR-RFLP的方法，即通過PCR擴(kuò)增包含多態(tài)位點的DNA片段，利用核酸限制性內(nèi)切酶識別該突變位點的特點，通過PCR產(chǎn)物純化、酶切獲得基因型。同時，國內(nèi)也有使用基因芯片檢測BMPR1B基因A746G突變位點的專利申請（201110126709.2）。這兩種方法需要使用核酸限制性內(nèi)切酶或基因芯片等特殊材料，增加了檢測成本和操作步驟。本發(fā)明利用AS-PCR方法，直接通過PCR擴(kuò)增獲得基因型，是一種快速、簡便、高效的分子診斷方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測綿羊高繁殖力BMPR1B基因的分子診斷方法。本方法從引物設(shè)計和優(yōu)化PCR反應(yīng)步驟著手，運(yùn)用AS-PCR策略，避免了傳統(tǒng)檢測方法中限制性內(nèi)切酶或基因芯片的使用，在PCR擴(kuò)增后直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得基因型結(jié)果。

本方法的工作原理：Taq?DNA聚合酶缺少3'→5'外切核酸酶活性，在一定條件下PCR引物3'末端的錯配導(dǎo)致產(chǎn)物的急劇減少。針對已知突變位點設(shè)計適當(dāng)?shù)囊铮梢酝ㄟ^PCR方法直接達(dá)到區(qū)分突變型與野生型基因的目的。本發(fā)明通過PCR擴(kuò)增綿羊BMPR1B基因突變位點A746G在內(nèi)的DNA片段，分別使用設(shè)計的兩組特異引物（第一組為公共正向引物與野生型反向引物，第二組為公共正向引物和突變型反向引物）。電泳檢測所得到的兩組擴(kuò)增產(chǎn)物，按照如下方法確定待測樣品的基因型：如果只有第一組擴(kuò)增產(chǎn)物檢測出131bp目的條帶，所述待測綿羊的基因型為++，即為野生型純合體；如果只有第二組擴(kuò)增產(chǎn)物檢測出131bp目的條帶，所述待測綿羊的基因型為BB，即為突變型純合體；如果兩組擴(kuò)增產(chǎn)物均能檢測出131bp目的條帶，則所述待測綿羊的基因型為B+，即為雜合體。

具體實施方式??以下實施方案將對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明：

一、總DNA來自綿羊血液，其提取的方法如下：

(1)?向1.5mL離心管（EP管）中加入200?μL血樣。加入500ul?SNET（1%?SDS，400?mM?Nacl，5?mM?EDTA，20?mM?Tris-cl?PH8.0），混勻。

(2)?向以上溶液中加入蛋白酶K至終濃度100ng/mL，混勻。

(3)?55℃孵育4h。

(4)?加入等體積的Tris-飽和酚，緩慢顛倒離心管數(shù)次，12000g?離心10min。

(5)?取水相于新的EP管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)，震蕩搖勻10min，12000g?離心10min。

(6)?取水相于新的EP管中，加入1/10體積的3M?NaAc及?2.5倍體積的無水乙醇，搖勻，-20℃靜置30min，12000g?離心10min。

(7)?去水相，干燥后用適量的超純水溶解，獲得DNA提取液用于下一步的PCR擴(kuò)增。

二、AS-PCR分析

1、??引物設(shè)計：

使用Primer?premier?version?5設(shè)計引物，引物如下：

公共正向引物:?5'-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3'；

突變型反向引物（突變型G）：5'-TTCATGCCTCATCAACACCGTCC-3'；

野生型反向引物（野生型A）：5'-TTCATGCCTCATCAACACCGTCT-3'。

擴(kuò)增片段長度為131bp。