[發(fā)明專(zhuān)利]一種電流型核酸適體傳感器及制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310163772.2
• 申請(qǐng)日: 2013-04-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103235025A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜利英;閆艷霞;陳青華;崔光照;姜素霞;王芬芬;胡杰;梁茂;岳保磊
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 鄭州輕工業(yè)學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): G01N27/416
• 分類(lèi)號(hào): G01N27/416;G01N27/327
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，采用電化學(xué)電流的檢測(cè)方法檢測(cè)托普霉素，該電流大小與托普霉素的濃度呈線性關(guān)系。

背景技術(shù)

托普霉素(TOB)是廣譜氨基糖苷類(lèi)抗生素之一，常用于治療惡性革蘭氏感染。由于這類(lèi)氨基糖苷類(lèi)抗生素具有潛在的耳毒性和腎毒性，對(duì)它的檢測(cè)在藥物研究中備受關(guān)注。與其它所有氨基糖苷一樣，托普霉素的分子結(jié)構(gòu)中缺少不飽和共軛鍵，自身沒(méi)有紫外或熒光吸收，因此，目前對(duì)它的檢測(cè)方法主要是色譜法、毛細(xì)管電泳法和EL?ISA等。但前兩種方法的檢測(cè)限都在200-900nmol/L，靈敏度不高。ELISA法雖將檢測(cè)限提高至53nmol/L，但操作步驟較繁雜。

核酸適體(aptamer)是指利用上個(gè)世紀(jì)末建立而發(fā)展起來(lái)的SELEX?(systematic?evolution?of?ligands?by?exponential?enrichment)體外篩選技術(shù)，從隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選獲得的短單鏈寡核苷酸配基，它能夠與靶分子特異結(jié)合，從而本身發(fā)生構(gòu)象變化。核酸適體作為一類(lèi)具有三維結(jié)構(gòu)的新型合成DNA/RNA寡核苷酸，能以強(qiáng)親合力和高選擇性識(shí)別靶分子，并具有易合成、易標(biāo)記、性質(zhì)穩(wěn)定、沒(méi)有免疫源性和毒性等優(yōu)勢(shì)，使其在檢測(cè)小分子生物靶標(biāo)方面更具有優(yōu)勢(shì)，為小分子化合物的特異性識(shí)別與檢測(cè)提供了廣闊的前景。

1998年Wang等篩選出托普霉素的RNA核酸適體后，人們利用標(biāo)記熒光基團(tuán)的托普霉素研究了托普霉素與其RNA核酸適體相互作用的機(jī)理，認(rèn)為核酸適體雖然是單鏈RNA，但其分子內(nèi)部分堿基仍能配對(duì)，折疊成環(huán)-莖結(jié)構(gòu)，其莖部大約有10個(gè)堿基對(duì).從而使托普霉素分子結(jié)合于環(huán)-莖連接附近的RNA大溝處，方曉紅等采用DNA光開(kāi)關(guān)復(fù)合物的熒光探針RU嵌入到堿基對(duì)中，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)托普霉素的檢測(cè)。但尚未見(jiàn)到將電化學(xué)電極與核酸適體分子結(jié)合構(gòu)建電流型適體傳感器檢測(cè)托普霉素的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)托普霉素在檢測(cè)過(guò)程中存在的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜等問(wèn)題，提供一種快速、準(zhǔn)確、方便，并可以與便攜式小型儀表配套的可用于檢測(cè)托普霉素的電流型適體傳感器。

本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種用于檢測(cè)托普霉素的電流型適體傳感器，該用于檢測(cè)托普霉素的電流型適體傳感器包括敏感膜片和電化學(xué)電極系統(tǒng)兩部分，其中敏感膜片固定有能特異性結(jié)合托普霉素的核酸適體，電化學(xué)系統(tǒng)為集成共面陣列薄膜電極。

進(jìn)一步，所述的集成共面陣列薄膜電極可以制備成兩電極系統(tǒng)，包括工作電極和對(duì)電極，也可以制備成三電極系統(tǒng)，包括工作電極、對(duì)電極和參比電極。

進(jìn)一步，所述的核酸適體需要與之部分互補(bǔ)的互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交形成雙鏈，雜交前需用TCEP打開(kāi)二硫鍵。

進(jìn)一步，所述的互補(bǔ)鏈的一端需標(biāo)記巰基，另一端可以無(wú)標(biāo)記，也可以標(biāo)記具有可逆電化學(xué)行為的電活性介質(zhì)。

進(jìn)一步，所述的標(biāo)記有電活性物質(zhì)的互補(bǔ)鏈需兩端互補(bǔ)，互補(bǔ)堿基對(duì)數(shù)為3-5個(gè)。

本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種用于檢測(cè)托普霉素的電流型適體傳感器的制備方法，該適體傳感器的制備過(guò)程包括以下步驟：

薄膜金電極的制備；

核酸適體的稀釋?zhuān)?/p>

核酸適體在薄膜金電極上的組裝。

進(jìn)一步，薄膜金電極的制備過(guò)程為：

(1)電極的形狀利用Artchut?Pro?for?cutter軟件設(shè)計(jì)，然后利用羅蘭刻字機(jī)GX-24刻制在薄膜塑料基板上；

(2)揭下電極形狀所覆蓋的塑料薄膜，然后利用磁控濺射技術(shù)濺射成厚度為150nm的金薄膜；

(3)將薄膜金電極先用大量酒精擦拭，再用大量雙蒸水沖洗，最后利用等離子清洗機(jī)清洗，密封保存。

進(jìn)一步，核酸適體的稀釋方法為：

合成好的核酸適體和互補(bǔ)鏈探針置于-20℃溫度下密閉保存；使用時(shí)，從冰箱冷凍室取出后需置于常溫下半小時(shí)，放入離心機(jī)以3000r/s的速度離心5分鐘；然后，利用PH7.4的PBS緩沖液將核酸適體和互補(bǔ)鏈稀釋成相同濃度；然后，將核酸適體和互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交，雜交時(shí)需要注意的是當(dāng)采用標(biāo)記型傳感器檢測(cè)靶分子時(shí)，選擇的核酸適體互補(bǔ)鏈的一端標(biāo)記巰基，另一端標(biāo)記具有電化學(xué)活性的基團(tuán)；當(dāng)采用無(wú)標(biāo)記型傳感器檢測(cè)靶分子時(shí)，選擇的核酸適體互補(bǔ)鏈的一端標(biāo)記上巰基，另一端無(wú)標(biāo)記；最后，雜交后形成的雙鏈通過(guò)Pt-S自組裝到薄膜金電極表面。

進(jìn)一步，核酸適體在薄膜金電極上的組裝方法為：