[發明專利]一種高通量全基因組DNA甲基化檢測技術

無效

• 申請號: 201310163085.0
• 申請日: 2013-05-06
• 公開（公告）號: CN103233072A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 王師;呂佳;包振民;張玲玲;胡曉麗;陸維
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于DNA甲基化檢測技術領域，具體涉及一種高通量全基因組DNA甲基化檢測技術。

背景技術：

DNA甲基化(DNA?methylation)是真核生物基因組DNA的一種重要的表觀遺傳學修飾，即在DNA甲基化轉移酶(DNA?methyltransferase,DNMT)的作用下，將S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基集團共價結合到DNA分子的胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶(5-^mC)的過程。DNA甲基化在維持高等生物正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育、衰老以及人類腫瘤的發生等生物學過程中起著重要作用。在無脊椎動物中，基因組DNA甲基化通過調控基因的表達模式，參與調節機體對環境的適應過程。因此，獲得全基因組范圍內所有胞嘧啶位點的甲基化數據，對于表觀遺傳學的時空特異性研究具有重要意義。

隨著甲基化研究的不斷深入，已經有多種甲基化分析方法以滿足不同甲基化研究的需要。在針對全基因范圍DNA甲基化的研究中，檢測的手段主要是基于芯片平臺的全基因組甲基化位點的篩選和基于高通量測序平臺的甲基化圖譜分析。其中芯片技術在模式生物的甲基化研究中是相對完善成熟的檢測工具，具有高覆蓋度、方便快捷，性價比高等特點，如?Illumina推出的人類全基因組甲基化芯片Human?Methylation?HD?450包含45萬個CpG位點，能夠覆蓋所有NCBI注釋的基因。操作流程簡單，能夠進行高通量甲基化位點的準確檢測。但針對遺傳信息相對匱乏的非模式生物，其芯片造價昂貴，甲基化位點選擇的靈活性不高，因而難以利用現有芯片平臺對非模式生物進行高通量全基因組甲基化的研究。

隨著新一代測序技術通量不斷提高和成本的降低，目前有很多基于二代測序平臺的全基因組甲基化檢測方法以得到應用，包括有全基因組重亞硫酸鹽測序(whole?genome?bisulfite?sequencing，BS-seq)?和簡化的表達重亞硫酸鹽測序?(reduced?representation?bisulfite?sequencing,?RRBS)、甲基化DNA?免疫共沉淀測序(methylated?DNA?immunoprecipitation?sequencing,?MeDIP-seq)、甲基化DNA?富集結合高通量測序(methylated?DNA?binding?domain?sequencing,?MBD-Seq)?和甲基化敏感性限制酶測序(methylation-sensitive?Restriction?Enzyme?sequencing,MRE-seq)等。這些技術都有其優缺點和適用范圍，如基于亞硫氫酸鹽處理的DNA甲基化檢測方法,?盡管作為DNA甲基化檢測的金標準，但操作復雜（重亞硫氫酸鹽處理），測序所需的成本較高，不適用于貝類等基因組較大的物種。?MeDIP-Seq是對特異性抗體富集的基因組上的甲基化區域進行高通量測序從而獲得全基因組范圍的甲基化位點。但該技術需要大量DNA，并且抗體的價格昂貴。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高通量全基因組DNA甲基化檢測方法，即一種適用于非模式生物的，低成本、簡單快速的高通量全基因組甲基化檢測方法，以彌補現有技術的不足。

本發明的全基因組DNA甲基化檢測方法，包括如下的步驟：

1）將基因組DNA用內切酶FspEI酶進行酶切，獲得酶切片段；

2）將酶切片段的兩端分別連接上接頭，作為擴增引物的結合點；

3）將連接上接頭的酶切片段用引物進行第一輪PCR擴增，從而富集接頭連接正確的酶切片段；

4）將第一輪PCR擴增產物經凝膠純化后用引物進行第二輪PCR擴增，引入Barcode來構建測序文庫；

5）測序文庫進行測序；將測序數據進行分析得到全基因組甲基化信息。

其中，步驟2）中的接頭，為接頭slx1和slx2，其中構成slx1的兩個核苷酸片段，其序列分別為5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′（SEQ?ID?NO:1）和3′-CGAGAAGGCTAGANNNNN-5′（SEQ?ID?NO:2），其中N為堿基A、T、G、C中的任一個；

構成slx2的兩個核苷酸片段，其序列分別為5′-GTGACTGGAGTTCAGAC

GTGTGCTCTTCCGATCT-3′（SEQ?ID?NO:3）和3′-CGAGAAGGCTAGANNNNN-5′?（SEQ?ID?NO:2）。