[發明專利]一種用于篩選轉基因動物生物標志物的血清代謝組學方法

有效

• 申請號: 201310162694.4
• 申請日: 2013-05-03
• 公開（公告）號: CN103278576A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 唐湘方;張宏福;韋家錦
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京科迪生專利代理有限責任公司 11251
• 代理人: 盧紀;顧煒

技術領域

本發明涉及分析化學和生命科學領域，具體涉及一種用于篩選轉基因動物生物標志物的代謝組學方法，是一種轉基因動物高通量檢測的新方法。

背景技術

轉基因動物是通過基因轉移技術獲得的整合有外源基因的動物個體。隨著生物科學技術的不斷完善，轉基因動物正以它特有的、潛在的優勢蓬勃發展，但我國乃至全球尚缺乏轉基因動物的有關檢測體系和標準。為此，開展轉基因動物快速、精準、高通量檢測方法研究勢在必行。

代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后新近發展起來的一門學科，其效仿基因組學和蛋白質組學的研究思想，對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方式，是系統生物學的重要組成部分，它借助高通量、高靈敏度與高精確度的現代分析技術，對生物體液中分子質量較低的代謝物及整體組成進行動態跟蹤和分析，借助多變量統計分析方法，來辯識和解析被檢測對象的生理、病理狀態及其與基因組成等的關系，考察生物體系受刺激或擾動后其代謝物組分或含量的變化，從而對轉基因產品進行篩選和鑒定。

代謝物是基因表達的終產物，基因表達上極微小的變化也可導致代謝物的大幅度改變，利用現代分析方法對某生物或細胞在特定生理時期內所有相對分子質量較低的代謝物（如小分子蛋白質、活性多肽、活性氨基酸及衍生物、胺類物質、單糖、脂類介質和金屬離子等）進行分析，通過考察生物體系受刺激或擾動后，其代謝物組分或含量的變化來篩選轉基因動物生物標志物，從而可鑒定轉基因產品，解決轉基因動物高通量檢測技術問題。

目前尚無篩選轉基因動物生物標志物的相關報道。

發明內容

本發明的目的在于建立一種采用超高效液相色譜質譜聯用技術篩選轉基因動物生物標志物的血清代謝組學方法。該方法能夠篩選出轉基因動物生物標志物，解決轉基因動物高通量檢測技術問題，為轉基因動物的深入研究提供根據。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：采用超高效液相色譜-質譜技術對正常動物與轉基因動物血清進行分析獲得代謝指紋圖譜，并通過多變量統計分析方法分析比較正常動物與轉基因動物代謝指紋圖譜差異，篩選出轉基因動物潛在生物標志物。

具體實現步驟如下：

（1）血清樣品采集：收集n只正常動物與m只轉基因動物的血液，血液分別置于不含肝素的負壓管中，負壓管在冰上凝集15-20min，在溫度為4-8℃、離心力為1600-1800g條件下離心時間15-20min后取上清液，即為所需的n+m個血清樣品；其中n為大于5的正整數，m為大于5的正整數；

（2）血清樣品預處理：于血清樣品中分別加入其2-4倍體積的乙腈沉淀蛋白，在溫度為2-4℃、離心力為12000-15000g條件下離心時間10-15min，后取上清液，即得到n+m個血清樣本；

（3）樣品質譜分析：對n+m個血清樣本依次進行超高效液相色譜質譜聯用分析，

液相色譜條件：采用Waters公司ACQUITY?UPLC液相色譜系統，該系統含二元溶劑管理器、樣品管理器和HT柱溫箱；色譜柱為Waters?ACQUITY^TM?UPLC?BEH?C18柱，規格為2.1mm×100mm，1.7μm；柱溫：45℃；進樣量：1-5μL；流動相：A為5mM甲酸氨+0.1%甲酸水溶液，B為5mM甲酸氨+0.1%甲酸（90%乙腈+10%水）溶液；梯度洗脫條件：0～1min為99%A相，1-23min線性變化至100%B相并保持3min，再切換99%A相并保持2min；流速為0.45ml/min，柱后流出液不經分流直接導入質譜系統檢測；

質譜條件：應用Waters?Xevo?G2QTof串聯四級桿飛行時間質譜系統進行檢測，其條件為電噴霧ESI離子源，掃描方式：正、負離子掃描模式，毛細管電壓：2.5KV，錐孔電壓：30V，離子源溫度：120℃，脫液劑氣溫度：450℃，錐孔氣流量：20L/h，脫液劑氣流量：800L/h，碰撞能量:10～40V，離子能量：1V，每0.2s采集1次圖譜，質量掃描范圍：20～1200m/z，依次獲得被分析血清樣品的總離子流圖；最終得到n+m個樣本的總離子流圖，其即為血清代謝指紋圖譜；