[發明專利]一種用于篩選轉基因動物生物標志物的血清代謝組學方法

有效

• 申請號: 201310162694.4
• 申請日: 2013-05-03
• 公開（公告）號: CN103278576A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 唐湘方;張宏福;韋家錦
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京科迪生專利代理有限責任公司 11251
• 代理人: 盧紀;顧煒

1.一種用于篩選轉基因動物生物標志物的血清代謝組學方法，其特征在于：采用超高效液相色譜-質譜技術對正常動物與轉基因動物血清進行分析獲得代謝指紋圖譜，并通過多變量統計分析方法分析比較正常動物與轉基因動物代謝指紋圖譜差異，篩選出轉基因動物潛在生物標志物；

所述獲得代謝指紋圖譜的具體實現步驟如下：

（1）血清樣品采集：收集n只正常動物與m只轉基因動物的血液，血液分別置于不含肝素的負壓管中，負壓管在冰上凝集15-20min，在溫度為4-8℃、離心力為1600-1800g條件下離心時間15-20min后取上清液，即為所需的n+m個血清樣品；其中n為大于5的正整數，m為大于5的正整數；

（2）血清樣品預處理：于血清樣品中分別加入其2-4倍體積的乙腈沉淀蛋白，在溫度為2-4℃、離心力為12000-15000g條件下離心時間10-15min，后取上清液，即得到n+m個血清樣本；

（3）樣品質譜分析：對n+m個血清樣本依次進行超高效液相色譜質譜聯用分析，

液相色譜條件：采用Waters公司ACQUITY?UPLC液相色譜系統，該系統含二元溶劑管理器、樣品管理器和HT柱溫箱；色譜柱為Waters?ACQUITY^TM?UPLC?BEH?C18柱，規格為2.1mm×100mm，1.7μm；柱溫：45℃；進樣量：1-5μL；流動相：A為5mM甲酸氨+0.1%甲酸水溶液，B為5mM甲酸氨+0.1%甲酸溶液；梯度洗脫條件：0～1min為99%A相，1-23min線性變化至100%B相并保持3min，再切換99%A相并保持2min；流速為0.45ml/min，柱后流出液不經分流直接導入質譜系統檢測；

質譜條件：應用Waters?Xevo?G2QTof串聯四級桿飛行時間質譜系統進行檢測，其條件為電噴霧ESI離子源，掃描方式：正、負離子掃描模式，毛細管電壓：2.5KV，錐孔電壓：30V，離子源溫度：120℃，脫液劑氣溫度：450℃，錐孔氣流量：20L/h，脫液劑氣流量：800L/h，碰撞能量:10～40V，離子能量：1V，每0.2s采集1次圖譜，質量掃描范圍：20～1200m/z，依次獲得被分析血清樣品的總離子流圖；最終得到n+m個樣本的總離子流圖，其即為血清代謝指紋圖譜。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（3）中，在對n+m個血清樣本依次進行超高效液相色譜質譜聯用分析過程中，每個樣本重復進樣5針，以監控實驗過程中超高效液相色譜質譜聯用儀有無較大系統偏差，考察其重現性，確保獲得可靠的數據。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（1）獲得的血清樣品可冷凍儲存于超低溫-80℃的冰箱中，備用。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述通過多變量統計分析方法分析比較正常動物與轉基因動物代謝指紋圖譜差異，是采用MetaboLynxTMXS數據處理軟件對n+m個樣本的血清代謝指紋圖譜據進行去噪音、質譜峰提取、反卷積處理、峰排列、對齊、合并、峰合并后開始列表去噪音、縫隙填補處理，得到各個峰的峰高或者峰面積以及質量數和保留時間數據，根據正常動物組和轉基因動物組譜圖的差異性比較，應用SPSS統計軟件進行主成分分析(Principal?Component?Analysis,PCA)和正交偏最小方差判別分析（Orthogonal?to?Partial?Least?Squares?Discriminant?Analysis,OPLS-DA），并選擇變量重要性因子對分類貢獻最大的檢測離子，這些檢測離子對應的代謝物被認為是轉基因動物代謝產生影響的生物標志物。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述篩選出轉基因動物潛在生物標志物，是對篩選出的標示物使用Elemental?Composition分子式預測軟件和MassFragment子離子確認軟件可以確證，最終對篩選出的標志物進行結構鑒定。