[發明專利]反相柱分離純化硫肽類抗生素諾卡沙星I的方法

無效

• 申請號: 201310162354.1
• 申請日: 2013-05-06
• 公開（公告）號: CN103232524A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 陳依軍;朱天翼
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C07K5/078
• 分類號: C07K5/078;C07K1/16;B01D15/32
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 汪旭東

技術領域

本發明涉及反相柱分離純化硫肽類抗生素諾卡沙星I的方法，屬于抗生素分離純化和精制技術領域。

背景技術

自1928年弗萊明發現青霉素和1942年瓦克斯曼發現鏈霉素以來，抗生素為人類的健康事業做出了卓越的貢獻。在人們應用抗生素治療疾病的同時，也鍛煉了細菌的耐藥能力，于是隨著抗生素的濫用以及病原性細菌的快速進化，臨床上已經出現了越來越多的耐藥菌株，特別是對多種抗生素都有抗性的菌株如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐青霉素的肺炎鏈球菌（PRSP），人們面對這類菌株的快速感染率往往顯得束手無策。隨著臨床上耐萬古霉素的革蘭氏陽性菌的逐漸增多，萬古霉素等糖肽類的抗生素一直以來被作為抗耐藥菌的最后防線的地位也變得岌岌可危。于是，尋求并且開發一些結構新穎、活性顯著的新型抗耐藥菌的藥物已經成為新藥研究的熱點和難點。

諾卡沙星I是由諾卡氏菌屬或擬無枝酸菌發酵獲得的新型硫肽類抗生素，其結構如式1所示，諾卡沙星I獨特結構使其能夠通過與核糖體50S大亞基的23S?rRNA以及L11蛋白形成復合物從而影響L11蛋白質的構象轉化，進而抑制蛋白質的合成而達到殺菌的作用（參見：Nat?Prod?Rep,1999,16(2):249～263）。其在ng/ml的水平便對絕大多數革蘭氏陽性菌特別是耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐青霉素的肺炎鏈球菌（PRSP）、耐萬古霉素的腸球菌（VRE）以及具有耐藥性的結核桿菌有著超強的殺菌活性，并且有報道指出其對金黃色葡萄球菌感染的小鼠模型也展現出了顯著的治愈效果（參見：Antimicrob?Agents?Chemother,2004,48(10):3697～3701）。因此，在多重耐藥菌頻繁出現的今天，諾卡沙星I十分具有研究前景及臨床應用價值。

諾卡沙星I結構復雜，主要通過微生物發酵提取的方法獲得，此途徑獲得的諾卡沙星I純度低，無法滿足臨床前及臨床研究的需要，目前主要通過正相硅膠柱層析的方法對諾卡沙星I進行純化，但這種方法純化能力有限、回收率低、工作量大、成本高（參見：專利號99898680.0的中國發明專利）。因此，為滿足研究及工業化的需要，開發一種便捷、高效、經濟的諾卡沙星I純化方法勢在必行。

式1：諾卡沙星I化學結構式

發明內容

針對現有純化方法的不足，本發明提供了一種高效、快捷、穩定的諾卡沙星I純化方法。

本發明的技術方案如下：

一種純化諾卡沙星I的方法，其特征在于，步驟如下：

1、將諾卡沙星I粗品溶解于二甲亞砜（DMSO）中，

2、將溶有諾卡沙星I粗品的DMSO溶液，利用反相硅膠柱梯度洗脫，收集僅有諾卡沙星I的組分，除去有機溶劑，水相用乙酸乙酯或氯仿萃取，萃取液蒸干后得到高純度諾卡沙星I產品。

上述步驟1中，優選的諾卡沙星I濃度為25-150mg/ml

優選的上述步驟2的柱層析純化方法，將溶有樣品的DMSO溶液加入已平衡的反相色譜柱頂端，打開色譜柱閥門，待樣品液進入色譜柱材后加入一定量的洗脫液I進行淋洗，再換成洗脫液II繼續淋洗。分段收集洗脫液II的流出液，并用薄層色譜監測，合并含有諾卡沙星I的組分，除去有機相，水相用乙酸乙酯或氯仿萃取，萃取液蒸干后得到產品。

上述步驟2的反相柱層析純化，優化的諾卡沙星I上樣量與硅膠的質量比為1:12000--1:2000。

上述步驟2的反相柱層析純化，優選的洗脫液I是乙腈和水混合液或甲醇和水混合液。

洗脫液I為乙腈和水混合液時，乙腈的體積分數優選為30-45%。

洗脫液I為甲醇和水混合液時，甲醇的體積分數優選為25-35%。

上述步驟2的反相柱層析純化，優選的洗脫液II是乙腈和水混合液或甲醇和水混合液。

洗脫液II是乙腈和水混合液時，乙腈的體積分數優選為35-50%。

洗脫液II是甲醇和水混合液時，甲醇的體積分數優選為40-50%。

進一步地，所用反相硅膠，粒徑為20-45μm，40-75μm和70-200μm中的一種或混合物。

本發明方法的優良效果如下：

1.本發明所涉及的純化方法操作簡單，重復性好。僅通過一步反相柱層析和萃取等常規操作即可獲得高純度諾卡沙星I。

2.本發明涉及的純化方法效率高，產品質量高。采用本發明的純化方法，諾卡沙星I的產率高達85%以上，純度大于98%。