[發(fā)明專利]一種載TGF-β3的緩釋組織工程滑膜鞘

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310161098.4
• 申請日: 2013-05-03
• 公開（公告）號: CN103239759A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 熊雁;蔣科;王愛民;張正治;王子明;鐘菁
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院
• 主分類號: A61L27/54
• 分類號: A61L27/54;A61L27/20;A61L27/38
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務(wù)所(普通合伙) 50211
• 代理人: 郭云

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)療領(lǐng)域，具體的說，涉及一種醫(yī)療用的緩釋抗粘連的組織工程滑膜鞘。

背景技術(shù)

手指屈指肌腱損傷后發(fā)生粘連愈合，導(dǎo)致手指的功能恢復(fù)效果不理想，是手外科領(lǐng)域亟待解決的一大難題。在肌腱愈合過程釋放的細胞因子中，TGF-β(Transforming?Growth?Factor?beta)認為是組織纖維化，瘢痕形成、肌腱粘連的關(guān)鍵因子。TGF-β3做為體內(nèi)TGF-β1的同分異構(gòu)體，可以下調(diào)TGF-β1和TGF-β2的水平，起到TGF-β1抗體的效果，達到抑制瘢痕的形成的作用。但是TGF-β3在體內(nèi)肌腱局部含量少，肌腱愈合環(huán)境內(nèi)TGF-β3的濃度無法保持，無法起到明顯抗粘連作用。

滑膜是關(guān)節(jié)囊的內(nèi)層，淡紅色，平滑閃光，薄而柔潤，由疏松結(jié)締組織組成。滑膜分泌滑液在關(guān)節(jié)腔內(nèi)，含有高度聚合的、高黏度的透明質(zhì)酸，充當(dāng)著關(guān)節(jié)內(nèi)的主要潤滑劑，它將關(guān)節(jié)軟骨的摩擦系數(shù)減至0.001。手指屈指肌腱斷裂，滑膜損傷后，不能正常分泌滑液，從而導(dǎo)致手指活動范圍小，容易產(chǎn)生粘連。

發(fā)明內(nèi)容

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種具有緩釋作用的抑制組織愈合處粘連形成的載TGF-β3的緩釋組織工程滑膜鞘。

本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的：一種載TGF-β3的緩釋組織工程滑膜鞘，支架由致密層(1)和多孔層(2)兩層組成，所述多孔層(2)呈網(wǎng)孔狀，該多孔層(2)內(nèi)載有含TGF-β3的殼聚糖微球以及滑膜細胞。

按照如下步驟制備：

a、所述致密層(1)的形成

將殼聚糖溶于2％的醋酸水溶液中，配制成1.5％的殼聚糖溶液，然后在4℃下離心5min，去除雜質(zhì)，靜置除氣泡后待用；將3.0ml上述溶液澆入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，室溫放置24h自然晾干形成致密層(1)；

b、多孔層(2)的形成

再將6ml1.5％的殼聚糖溶液傾入放置致密層(1)的培養(yǎng)皿中，-20℃預(yù)凍2h后冷凍干燥形成多孔層(2)得到殼聚糖不對稱膜；

c、含TGF-β3的殼聚糖微球的制備

將殼聚糖120mg溶于2％的醋酸水溶液中，磁力攪拌，配成2％的殼聚糖溶液；在該殼聚糖溶液中加入0.1mg/ml的TGF-β3溶液5ug，攪拌混勻，靜置除氣泡后待用；在燒杯中加入80ml液體石蠟，調(diào)整攪拌速度至1000rpm，滴加乳化劑Span-80?4ml；用無菌注射器將含TGF-β3的殼聚糖溶液緩慢逐滴加至液體石蠟中，攪拌乳化至顏色呈均一穩(wěn)定乳白色；加入0.4ml的50％戊二醛溶液與殼聚糖攪拌固化30分鐘，靜置固化30分鐘，淡黃色微球沉淀于杯底；傾去上層油相，用石油醚反復(fù)清洗微球，倒去上層石油醚，下層微球室溫放置揮發(fā)30分鐘，得含TGF-β3的殼聚糖微球；

d、載TGF-β3的緩釋組織工程膜制備：

將步驟(b)中得到的殼聚糖不對稱膜裁成直徑為1cm的圓片，準(zhǔn)確稱量含TGF-β3的殼聚糖微球5mg，移液槍吹打分散懸于100ul的PBS溶液，吸取含懸浮微球的PBS溶液，加入多孔層(2)，使微球均勻吸附到殼聚糖膜的孔隙中得到載TGF-β3的殼聚糖緩釋膜；

e、TGF-β3緩釋組織工程滑膜鞘的制備

在無菌條件下取新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織，用無菌PBS溶液清洗三遍組織塊后，在超凈臺內(nèi)剪切成碎粒，將碎粒移至10mL離心管內(nèi)，加入0.1％胰蛋白酶DMEM溶液，震蕩消化30分鐘，1000rpm離心5min，去上清液，加入0.1％的II型膠原酶DMEM溶液，放置于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO₂的恒溫搖床內(nèi)消化2h，觀察組織碎片大部分被消化，液體混濁，離心，去上清液；PBS沖洗1次，100目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，離心、去上清；加入含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液5mL，充分吹打均勻后，移至無菌培養(yǎng)皿；放入CO₂恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；每三天換液一次，5～7天傳代；

將滑膜細胞懸液調(diào)整濃度為2x10⁵個/mL，用加樣器吸取細胞懸液100ul均勻加入TGF-β3殼聚糖緩釋膜的多孔層中，孵育3h，再向培養(yǎng)孔中加入含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，使得滑膜細胞貼附TGF-β3殼聚糖緩釋膜多孔層生長，將片狀滑膜細胞-TGF-β3殼聚糖緩釋膜復(fù)合物包繞于事先消毒好的硅膠管上，使其成管形結(jié)構(gòu)，得到載TGF-β3的緩釋組織工程滑膜鞘。

作為優(yōu)選：所述多孔層(2)厚度為200-300um。